天然燕麦肽的提取工艺优化及生物活性初探

徐建国 郝艳芳 介琳霞 田呈瑞 闫华娟

天然燕麦肽的提取工艺优化及生物活性初探

徐建国1，2郝艳芳1介琳霞1田呈瑞2闫华娟1

(山西师范大学食品科学与工程系1，临汾 041004)
(陕西师范大学食品工程与营养科学学院2，西安 710062)

以山西产裸燕麦为原料，采用单因素和二次回归旋转组合试验研究了不同因素对燕麦肽得率的影响，确定了天然燕麦肽提取的最佳工艺参数，并探讨了燕麦肽的生物活性。试验结果表明，在试验范围内各因素对燕麦肽得率的影响程度由大到小依次为:提取温度、料液比、提取时间。提取燕麦肽的最优工艺参数为液料比16∶1(mL/g)，提取时间72 min，提取温度34℃。在此条件下，试验得到的燕麦肽得率为5．54 mg/g。生物活性试验结果表明，天然燕麦肽具有一定的抗氧化和降血压活性。

燕麦 肽 生物活性

作为一种人类和动物消费的谷物，燕麦(Avena L．)营养丰富，且富含酚类物质、甾醇、植酸、维生素E 等多种生物活性成分［1－3］，具有抗氧化、降血压、降血脂和降血糖等多种生理功能［4－6］。特别是燕麦蛋白质，含量高且营养均衡［7］，近年来一些研究人员利用燕麦蛋白通过酶解制备生物活性肽。管骁等［8］利用胰蛋白酶水解燕麦蛋白制备并分离出一种新的强活性的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽，确定其氨基酸序列为 Glu－Gly－Gly－Tyr－Arg;韩扬等［9］研究了超声辅助 Alcalase酶直接水解燕麦麸皮制备燕麦ACE抑制肽的工艺条件，提高了抑制肽的含量和活性;马海乐等［10］采用超声波预处理燕麦蛋白后，再用碱性蛋白酶水解制备ACE抑制肽，不但提高了肽活性，而且缩短了酶解时间。以上研究均是利用外源酶水解燕麦蛋白制备生物活性肽，表明燕麦是一种良好的ACE抑制肽蛋白源。但遗憾的是，关于燕麦中天然肽的提取及其生物活性研究还未见报道。本研究主要优化天然燕麦肽的提取工艺，探讨其抗氧化性及ACE抑制活性，以期为燕麦资源的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1．1 试验材料及试剂

燕麦:来自于山西吕梁地区;1，1－苯基－2－苦肼基自由基(DPPH)、2，2－联氮－3－乙苯－二噻唑－6磺酸(ABTS)、水溶性维生素E(Trolox)、血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酰－组氨酰－亮氨酸(Hip－His－Leu，HHL):Sigma公司;Fe3+－三吡啶三吖嗪(TPTZ):Fluka公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、还原型谷胱甘肽:西安舟鼎国生物技术有限责任公司。

1．2 主要仪器与设备

XW－80A旋涡混合仪:海门市其林贝尔仪器制造有限公司;5840R冷冻离心机:Gene公司;TU－1900紫外分光光度计:北京普析通用有限公司。

1．3 试验方法

1．3．1 肽的提取

称取燕麦籽粒，粉碎后放入锥形瓶中，正己烷脱脂处理。干燥后加入一定量的0．1 mol/L Tris－HCl缓冲液(pH 8．8)提取一定的时间后，在4℃，5 000 r/min离心15 min取上清液。上清液中加入等体积12%三氯乙酸，混合后静置30 min，在4℃，10 000 r/min离心15 min沉淀大分子蛋白质，所得上清液即为燕麦肽提取液。

1．3．2 肽含量的测定

肽含量测定采用双缩脲法，以还原型谷胱甘肽为标准品，建立的回归方程为:y=0．124x+0．001 4(0 ～100 g/mL，R2=0．999 6)，其中 y为吸光度，x表示肽含量，单位为μg/mL。

1．3．3 燕麦肽提取工艺的优化

在单因素试验结果的基础上，进行二次回归正交旋转组合设计试验，采用DPS统计分析软件对试验结果进行分析，优化提取工艺。各因素水平及编码如表1所示。

表1 试验因素和编码水平表

1．3．4 燕麦肽生物活性测定

1．3．4．1 DPPH 自由基清除能力的测定

测定方法参照文献［11］稍作修改，取0．5 mL提取液和4．5 mL 60μmol/L的DPPH甲醇溶液混匀，室温下避光静置30 min后517 nm下测吸光度。

DPPH自由基的清除率=(1－A1/A0)×100%

式中:A0为0．5 mL甲醇+4．5 mL DPPH溶液的吸光度;A1为0．5 mL样品溶液+4．5 mL DPPH溶液的吸光度。

为进一步说明燕麦对DPPH自由基的清除能力，以水溶性维生素E(Trolox)溶液做标准对照，以浓度为横坐标，清除率为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程为 y=0．717 3x－1．96(20 ～120 μmol/L，R2=0．999 8)，DPPH自由基的清除能力结果以每100克燕麦样品相当于Trolox的微摩尔数表示。

1．3．4．2 铁还原能力(FRAP)的测定

测定方法根据文献［11］进行。

1．3．4．3 ABTS 自由基清除能力的测定

测定方法根据文献［12］进行。

1．3．4．4 ACE 抑制活性测定

参照文献［13］稍作修改。取5 mmol/L Hip－His－Leu(HHL)溶液 80 μL(pH 8．3，0．1 mol/L 硼砂－硼酸缓冲液含0．3 mol/L NaCl)与40μL燕麦肽混合。37℃水浴预热5 min后，加入10μL ACE溶液(0．25 U溶于2．5 mL同样的缓冲液)，继续保持37℃水浴 30 min。随后加入 1 mol/L HCl溶液200μL终止反应，再加入冷冻后的乙酸乙酯1．2 mL，旋涡混合均匀，以萃取反应体系中的马尿酸。3 000 r/min离心10 min后取出0．9 mL酯层溶液转入另一试管中，90℃烘箱烘干，并重新溶于3 mL去离子水中，在228 nm波长处测定吸光值。ACE抑制率计算公式为:

式中:A1为不存在ACE抑制肽时的吸光度;A2为ACE及ACE抑制肽都存在时的吸光度;A3为ACE及ACE抑制肽都不存在时的吸光度。

2 结果与分析

2．1 燕麦肽提取的单因素试验

2．1．1 液料比对肽得率的影响

固定提取温度为30℃，提取时间为60 min，考察液料比对肽得率的影响。结果见图1。由图1可知，燕麦肽得率随着液料比的提高而逐渐增加，当液料比高于15∶1(mL/g)时，燕麦肽得率没有明显变化。液料比过大不但会增加溶剂用量，而且会增加后续工艺的难度。因此，提取时选择液料比为15∶1较为合适。

图1 液料比对肽得率的影响

2．1．2 提取时间对肽得率的影响

固定提取温度为30℃，液料比为15∶1，考察提取时间对肽得率的影响。提取时间对燕麦肽得率的影响结果见图2。由图2可知，随着提取时间的延长，肽的得率明显增加，提取60 min时，基本达到最大值，此后再延长提取时间，肽得率并没有明显增加。可能是由于浸提时间的延长，肽越来越多溶解到溶液里所致，当体系达到内外渗透平衡时，肽得率基本趋于稳定。因此确定最佳提取时间为60 min。

图2 提取时间对肽得率的影响

2．1．3 提取温度对肽得率的影响

固定提取液料比为15∶1，提取时间为60 min，考察提取温度对肽得率的影响。提取温度对燕麦肽得率的影响结果见图3。由图3可知，提取温度在4～30℃范围内，随着提取温度的升高，肽得率明显增加，温度为30℃时，基本达到最大值。主要是由于随着温度的升高，分子运动加剧，肽在浸提液中的溶解度增大。当温度在30～40℃肽得率没有明显变化，此后，随着温度的升高，肽得率有下降的趋势，原因可能是较高的温度会使燕麦淀粉糊化，阻碍肽的溶出。另外，过高的提取温度也会造成肽的热变性。因此确定最佳提取温度为30℃，不宜超过40℃。

图3 提取温度对肽得率的影响

2．2 二次回归旋转组合试验优化燕麦肽提取工艺

2．2．1 二次回归旋转组合设计结果

由DPS统计分析软件的试验设计功能可知，三因子二次回归旋转组合设计包括23个试验方案，具体试验方案及试验结果如表2所示。

表2 试验设计及结果

2．2．2 回归方程的建立与检验

根据表2结果，建立燕麦肽得率与液料比X1、提取时间X2、提取温度X3的三因子的数学回归模型为:Y=5．371 2+0．263 3X1+0．245 4X2+0．309 2 X3－0．330 1X12－0．195 8X22－0．171 0X32－0．131 3X1X2－0．136 3X1X3+0．058 8X2X3。由方差分析(表3)可知，回归方程的失拟性检验 F1＜F0．05(5，8)，差异不显著;显著性检验 F2＞ F0．01(9，13)，差异极显著，这说明所建立的二次回归模型是适当的。在α=0．10显著水平剔除不显著项，得到优化后的方程为:Y=5．371 2+0．263 3X1+0．245 4X2+0．309 2X3－0．330 1X1

2－0．195 8X22－0．171 0X3

2－0．136 3X1X3。

2．2．3 各因素的影响程度分析

各因素的F值可以反映出各因素对试验指标的重要性。从方差分析结果可知，对燕麦肽得率影响程度的因素由大到小依次为提取温度、液料比、提取时间。

表3 试验结果方差分析表

2．2．4 双因素交互作用分析

由表3可知，本试验所建立的数学回归模型中，在α=0．10水平上，只有X1和X3因素交互作用显著，即液料比和提取温度的交互作用对燕麦肽得率有显著的影响。因此，固定提取时间于零水平，得到液料比和提取温度交互作用的响应曲面图和等高线图如图4所示。

由图4可知，燕麦肽得率随液料比和提取温度的变化会产生较大变化。随着二因素编码值的升高，肽得率呈明显上升趋势，但当编码值达到一定的组合后，肽得率开始下降。原因可能是过大的液料比使分离效率降低，肽损失率增加;过高的温度会导致淀粉的糊化，影响肽的溶出，这与单因素的分析结果一致。由此可知，只有当液料比和提取温度合理搭配时才能获得更好的提取效果。

图4 液料比与提取温度对肽得率的交互作用分析

2．2．5 提取工艺参数的优化及验证

通过DPS软件分析，采用频率分析方法寻找最优提取条件，其中肽得率高于4．96 mg/g的方案有25个，频率分析结果见表4。由表4可知，在95%的置信区间内肽得率高于4．96 mg/g的优化提取方案为:液料比14．886 ～16．554 mL/g，提取时间66．12 ～78．52 min，提取温度32．48 ～35．7 ℃，取优化后提取条件的平均值方案，X1=0．24，X2=0．616，X3=0．818，即液料比 15．72 mL/g，提取时间 72．32 min，提取温度34．09℃。为便于指导实际生产，将最优组合方案定为:液料比16 mL/g，提取时间72 min，提取温度34℃。按最优组合方案中的提取条件进行验证试验，重复三次，取平均值，测得燕麦肽得率Y=5．54 mg/g，与理论值(5．60 mg/g)接近，其相对误差为1．07%，进一步验证了数学回归模型的适合性。

表4 大于4．96 mg/g的25个方案中各变量取值的频率分布

2．3 天然燕麦肽的生物活性研究

天然燕麦肽的生物活性性测定结果见表5。由表5可知，燕麦中肽清除DPPH、ABTS自由基的能力分别相当于 0．21、9．96 μmol Trolox/100 g燕麦，铁还原能力为1．08μmol Fe(Ⅱ)/g燕麦，ACE抑制率为4．42%。试验结果说明，天然燕麦肽不但具有一定的抑制ACE活性，而且具有抗氧化性。然而天然燕麦肽的结构及作用机制等还有待深入研究。

表5 燕麦肽的抗氧化性和ACE抑制活性

3 结论

3．1 通过试验结果的方差分析可知，在本试验范围内，各因素对天然燕麦肽得率的影响作用大小顺序依次为:提取温度、液料比、提取时间。

3．2 天然燕麦肽提取条件的数学回归模型为:Y=5．371 2+0．263 3X1+0．245 4X2+0．309 2X3－0．330 1X12－0．195 8X22－0．171 0X32－0．136 3X1X3。采用此模型在本试验范围内能较准确地预测天然燕麦肽的得率。

3．3 通过频率分析方法得到的最优提取条件为:液料比16∶1(mL/g)，提取时间72 min，提取温度34℃。在此条件下，预测燕麦肽得率为5．60 mg/g，试验得到的燕麦肽得率为 5．54 mg/g，其相对误差为1．07%，进一步验证了数学回归模型的适合性。

3．4 天然燕麦肽具有一定的抗氧化能力和降血压活性，但对于天然燕麦肽的分离纯化、组分及结构鉴定等，还有待于进一步研究。

志谢:山西省大学生创新性实验项目资助。

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Primary Study on Extracting Tech－nology Optimization and Biological Activity of Peptides from Natural Oat Groats

Xu Jianguo1，2Hao Yanfang1Jie Linxia1Tian Chengrui2Yan Huajuan1
(Department of Food Science and Engineering，Shanxi Normal University2，Linfen 041004)
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University1，Xi'an 710062)

Taking the naked oat seeds as raw materials，the effects of different factors on peptide yield and optimum parameters for extraction Tech－nology of natural peptide from oat groats were determined by the single－factor experiment and quadratic orthogonal rotation regression combination design and the bioactivity of peptides was investigated．The result showed that the effect sequences of three factors for peptide yield were as follows:extraction temperature，liquid－to－solid ratio，and extraction time．The optimal extraction parameters were as follows:liquid－tosolid ratio of 16∶1(mL/g)，extraction time of 72 min，and extraction temperature of 34 ℃．Under the said conditions，the yield of peptide from oat groats was 5．54 mg/g．The biological activity test exhibited that the oats had certain antioxidant activity and effect of reducing blood pressure．

oat，peptide，bioactivity

TS201．1

A

1003－0174(2012)01－0020－05

山西省高校科技开发项目(2010112)

2011－03－24

徐建国，男，1971年出生，副教授，食品科学