HPLC法测定杜仲粗皮及杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量

吴慧敏，孔 军，杜红岩，李 钦＊

（1.河南大学 中药研究所，河南 开封475004；2.河南大学 学生处，河南 开封475001；3.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州450003）

杜仲为杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的干燥树皮。我国第一部药学专著《神农本草经》将其列为上品，具有补肝肾、强筋骨、降血压等功效，尤其是对高血压具有独特的疗效，是理想的天然降压 药 物［1－2］。松 脂 醇 二 葡 萄 糖 苷 （pinoresinol diglucoside，PDG）为杜仲主要降压成分之一［3－8］。杜仲的加工方法［9－10］：每年4～6月剥取，刮去粗皮，堆置“发汗”至内皮呈紫褐色，晒干。松脂醇二葡萄糖苷在杜仲树皮中的分布，未见报道。根据杜仲树皮的形态特点（树皮开裂状况），把杜仲分为4种变异类型，即深纵裂型、浅纵裂型、龟裂型和光皮型［11－12］，4种变异类型中粗皮所占的比例，会影响药材质量。

为了搞清杜仲加工过程中刮去粗皮的合理性，我们采用HPLC法测定杜仲4种变异类型粗皮及杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量，并比较了4种变异类型杜仲粗皮所占的比例，现报道如下。

1 仪器与试药

LC-2010A 高效液相色谱仪（日本岛津）；CLASS-VP数据处理工作站；AG135型电子分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；Diamonsil-C18色谱柱（5μm，150mm×4.6mm）。甲醇为色谱纯；水为高纯水；其余所用试剂均为分析纯；松脂醇二葡萄糖苷对照品（中国药品生物制品鉴定所提供，供含量测定用，批号：111537-200501）。

4种变异类型杜仲（深纵裂型、浅纵裂型、龟裂型和光皮型）均采自河南省嵩县闫庄乡中国林科院杜仲种植基地（4～6月剥去12a生的杜仲干皮，刮去粗皮，堆置“发汗”至内皮呈紫褐色，晒干）；光皮型杜仲分别采自河南商丘、河南鹤壁、湖北郧西、河南灵宝（6月中旬剥去12a生的杜仲干皮，刮去粗皮，堆置“发汗”至内皮呈紫褐色，晒干）；杜仲粗皮为以上4种变异类型杜仲刮下的粗皮（主要为木栓层），干燥，即得。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的配制 精密称取松脂醇二葡萄糖苷对照品2.47mg，甲醇溶解配制成质量浓度为0.494g／L对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备［4］选择4种变异类型杜仲，将不同产地的杜仲皮的粗皮刮下，粗皮、杜仲分别粉碎。分别取样品2g，精密称定，置索氏提取器中，加入三氯甲烷适量，加热回流6h，弃去三氯甲烷，药渣挥去三氯甲烷，再置索氏提取器中，加入甲醇适量，加热回流6h，提取液回收甲醇至适量，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

色 谱 柱：Diamonsil-C18柱 （5μm，150mm ×4.6mm）；流 动 相：甲 醇－水 （23∶77）；流 速：1.0mL／min；柱温：室温；检测波长：277nm；进样量：5μL。在该色谱条件下，松脂醇二葡萄糖分离度良好，不受药材中杂质的干扰，结果分别见图1、图2、图3。

2.3 标准曲线及线性范围

分别精密吸取松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液（0.496g／L）1、2、4、6、8、10μL溶液，注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积，以松脂醇二葡萄糖苷的进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得 回 归 方 程：Y ＝535 616 X ＋25 303，r＝0.999 9。结果表明，松脂醇二葡萄糖苷在0.496～4.960μg范围内，进样量与其色谱峰面积成良好的线性关系。

2.4 精密度实验

精密吸取松脂醇二葡萄糖苷标准品溶液适量，连续5次进样，记录峰面积，计算RSD为1.38%，n＝5。

2.5 稳定性实验

取同一批光皮型（河南商丘）杜仲粉末约2g，精密称定，按“2.1.2”方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10h进样5μL，测定，松脂醇二葡萄糖苷峰面积积分值RSD为1.58%，表明样品溶液中松脂醇二葡萄糖苷在10h内稳定。

图1 松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液HPLC图谱

图2 杜仲样品溶液HPLC图谱

图3 杜仲粗皮样品溶液HPLC图谱

表1 加样回收率测定结果

2.6 重复性实验

取同一批光皮型（河南商丘）杜仲粉末约2g，6份，精密称定，分别按“2.1.2”方法制备供试品溶液，进样5μL，记录峰面积，计算松脂醇二葡萄糖苷的含量，RSD值为1.5%。

2.7 回收率实验

取同一批（河南商丘）已知含量的光皮型杜仲粉末约1g，6份，精密称定，分别加入一定浓度的PDG对照品适量，按照“2.1.2”项下供试品制备方法制备供试品溶液，并分别进行测定，测定峰面积，计算回收率。结果表明，本方法的回收率符合要求，见表1。

2.8 样品测定

分别精密称取不同产地光皮型杜仲及粗皮各2g，按照“2.1.2”制备供试品溶液，按前述色谱条件测定，结果见表2。分别精密称取4种变异型杜仲及粗皮各2g，按照“2.1.2”制备供试品溶液，按前述色谱条件测定，结果见表3。

表2 不同产地光皮型杜仲及粗皮中松脂醇二葡萄糖苷含量（n＝3）

表3 不同变异型杜仲及粗皮中松脂醇二葡萄糖苷含量（n＝3）

2.9 不同变异类型全杜仲皮中杜仲和粗皮的测定

分别称取4种变异类型的粗皮，计算4种杜仲皮中的粗皮所占总皮的百分数，结果见表4。

表4 不同变异类型全杜仲皮中杜仲及粗皮测定结果（n＝3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

参考《中国药典》2010版一部“杜仲”项下含量测定方法，以甲醇－水（25∶75）为流动相，分离效果不好。经优选流动相为甲醇－水（23∶77）分离，效果较为理想。

3.2 不同产地光皮型全杜仲不同部位松脂醇二葡萄糖苷的含量分析

松脂醇二葡萄糖苷主要存在于去粗皮的杜仲中，河南商丘产光皮杜仲松脂醇二葡萄糖苷含量最高，河南鹤壁产光皮杜仲松脂醇二葡萄糖苷含量最低。4种产地光皮杜仲的粗皮松脂醇二葡萄糖苷含量检测不到。

3.3 4种变异类型杜仲粗皮及杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量分析

松脂醇二葡萄糖苷主要存在于4种变异类型的杜仲中，4种变异类型的杜仲粗皮中含量检测不到。不同变异类型杜仲中粗皮所占重量有明显差异，光皮型粗皮所占比例最低为6.3%，龟裂型粗皮所占比例最高为13.6%，粗皮中几乎不含杜仲主要成分松脂醇二葡萄糖苷。以上测定结果，为中国药典杜仲的加工方法提供了理论依据。

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