一种快速测定毛竹半纤维素中糖醛酸含量的方法

林 妲 彭 红 阮榕生 余紫苹 刘玉环

(南昌大学生物质转化教育部工程技术研究中心，江西南昌，330047)

一种快速测定毛竹半纤维素中糖醛酸含量的方法

林 妲 彭 红 阮榕生 余紫苹 刘玉环

(南昌大学生物质转化教育部工程技术研究中心，江西南昌，330047)

采用间羟基联苯比色法测定毛竹半纤维素中葡萄糖醛酸含量，并研究了四硼酸钠/硫酸、间羟基联苯溶液添加量及沸水浴时间对测定结果的影响，建立了适合于毛竹半纤维素中糖醛酸含量的测定条件，同时证明了该方法测定毛竹半纤维素中葡萄糖醛酸的稳定性、可重复性和精密度。

毛竹半纤维素;葡萄糖醛酸;间羟基联苯比色法

毛竹又名“楠竹”、“孟宗竹”，禾本科竹亚科刚竹属，单轴散生型，常绿乔木状竹类植物。毛竹面积占我国竹林总面积的70%，其生长速度快、繁殖能力强、生态功能显著，在可再生资源中占有重要地位［1］。毛竹作为一种可再生天然资源被广泛应用于食品、造纸、化学、制药等行业中，其半纤维素含量约为20% ～35%［2］，所以分离毛竹半纤维素并深入研究其结构是开发毛竹资源、提高毛竹半纤维素资源附加值的前提条件。

毛竹作为禾本科植物，其半纤维素为聚木糖类半纤维素，主要是聚阿拉伯糖-4-O-甲基葡萄糖醛酸木糖。即以 (1→4)-β-D-聚木糖为主链，阿拉伯糖和4-O-甲基-α-D-葡糖醛酸或D-葡萄糖醛酸作为侧链分别以C-3位和 C-2位与主链相连［3］，其结构如图1所示。

由于葡萄糖醛酸是毛竹半纤维素支链的重要组成部分，其含量在一定程度上反应了提取条件是否会破坏毛竹半纤维素结构，因此，检测毛竹半纤维素中的葡萄糖醛酸含量成为重要的检测指标之一。常用的糖醛酸含量测定方法有硫酸-咔唑法、间羟基联苯比色法、离子色谱法、气相分析和液相分析法等，前两者较为常用。但是由于天然产物中的中性己糖和戊糖对咔唑造成干扰，会影响糖醛酸含量测定的准确性。比较而言，间羟基联苯比色法更为快速、简便，也更精确［5］。因此本实验采用间羟基联苯比色法测定毛竹半纤维素中葡萄糖醛酸含量，并考察最佳测定条件，以期找到测定毛竹半纤维素中葡萄糖醛酸含量的最佳测定方法。

1 实验

1.1 仪器与试剂

主要仪器与设备:UV9100型紫外-可见分光光度计 (北京莱博泰科仪器有限公司);DHG-9036A型电热恒温鼓风干燥箱 (上海精密实验设备有限公司);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司);TDL-5000B型大容量离心机 (上海安亭仪器厂);Sartorius电子天平 (北京赛多利斯仪器系统公司);SK200H超声处理器 (上海科导超声仪器有限公司)。

图1 聚木糖类半纤维素结构式

试剂及材料:本实验所选取的毛竹原料取自南昌梅岭官溪村当地天然竹林，晒干后切成小片经粉碎，收集40～100目筛粉末备用。无水乙醇，95%乙醇，乙酸，甲苯，氢氧化钠，硫酸，葡萄糖醛酸，间羟基联苯，四硼酸钠，均为分析纯;亚氯酸钠为化学纯。

1.2 实验方法

1.2.1 制备毛竹半纤维素样品

毛竹半纤维素为实验室自制，采用碱分级分离方法［6］。毛竹样品经索氏抽提脱除蜡质和色素等杂质再经亚氯酸钠、冰醋酸脱木素后得到毛竹综纤维素。综纤维素按固液比1∶20在2%NaOH［7-8］溶液中55℃下抽提2.5 h后用冰醋酸中和至pH值为5.5，再经4800 r/min离心20 min，收集沉淀即为半纤维素A组分，标记为AH1。浓缩上清液，经3倍体积95%乙醇沉淀过夜，收集沉淀并经70%乙醇洗涤，得到半纤维素B组分，标记为BH1。剩余残留物继续经过5%NaOH抽提，过程同上，得到半纤维素A组分，标记为AH2，半纤维素B组分，标记为BH2。

1.2.2 配制对照品溶液

(1)葡萄糖醛酸标准溶液:称取干燥至恒重的葡萄糖醛酸标准品25.00 mg，加水溶解并定容至25 mL，混匀，制备成1.00 mg/mL的标准溶液，备用。

(2)四硼酸钠/硫酸溶液:准确称取0.478 g四硼酸钠溶解于100 mL浓硫酸中，备用。

(3)间羟基联苯溶液:准确称取0.15 g间羟基联苯溶解于5 mg/mL氢氧化钠溶液中，定容至100 mL，其质量浓度为1.5 mg/mL，暗处保存，保持4℃条件下放置1个月以上备用［9］。

2 结果与讨论

2.1 实验条件选择

2.1.1 最大吸收波长采用葡萄糖醛酸标准溶液配置成0.05 mg/mL葡萄糖醛酸溶液，置于具塞试管中，加入四硼酸钠/硫酸溶液5 mL，振荡使其混合均匀，再沸水浴5 min，冰水浴冷却后加入间羟基联苯溶液100 μL，振荡混合均匀，使用超声仪脱气，蒸馏水作为对照，在200～800 nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长为524 nm。

2.1.2 四硼酸钠/硫酸溶液用量

热的浓硫酸可有效降解多聚糖，毛竹半纤维素为聚阿拉伯糖木糖，在热浓硫酸作用下可降解成为单糖，同时释放出葡萄糖醛酸单体，四硼酸钠增加了葡萄糖醛酸在间羟基联苯作用下显色的敏感性。故四硼酸钠/硫酸溶液的用量对测定结果会产生一定程度的影响。本实验在1 mL葡萄糖醛酸标准溶液中加入不同量四硼酸钠/硫酸溶液，再加入100 μL间羟基联苯溶液，沸水浴5 min，在此条件下测定吸光度，以蒸馏水作为空白对照样。结果见表1。

表1 不同用量四硼酸钠/硫酸溶液测得吸光度值

由表1可知，随四硼酸钠/硫酸溶液用量的增加，混合反应体系吸光度先增高然后降低，其吸光度最大值对应的四硼酸钠/硫酸溶液用量为5 mL。因此，四硼酸钠/硫酸溶液最佳用量为5 mL。

2.1.3 间羟基联苯溶液用量

经水解的葡萄糖醛酸可与间羟基联苯溶液发生显色反应，生成紫红色透明溶液，为考察间羟基联苯用量对毛竹半纤维素糖醛酸含量测定结果的影响，本实验在1 mL葡萄糖醛酸标准溶液中加入不同量间羟基联苯溶液，再加入5 mL四硼酸钠/硫酸溶液，沸水浴5 min，在此条件下测定吸光度，以蒸馏水作为空白对照样。测定结果见表2。

由表2数据可知，吸光度最大时对应的间羟基联苯溶液用量为120 μL，因此确定间羟基联苯最佳用量为 120 μL。

表2 不同用量间羟基联苯溶液测得的吸光度值

表3 不同沸水浴时间下测得的吸光度值

2.1.4 沸水浴时间

由于多糖在硫酸中的水解需要在加热条件下进行，因此，加热时间会影响水解程度进而影响反应体系的吸光度，最终对测定结果造成影响。本实验取1 mL葡萄糖醛酸标准溶液，在不同沸水浴时间条件下，加入5 mL四硼酸钠/硫酸溶液、120 μL间羟基联苯溶液，测定吸光度，以蒸馏水作为空白对照。测定结果见表3。

由表3可知，沸水浴加热3 min后吸光度较稳定，随加热时间的延长吸光度缓慢地增长，6 min时达到最大值，之后吸光度有所下降，加热10 min后吸光度再次回升，表明加热时间太长可能影响吸光度的稳定性，因此选择沸水浴加热时间为6 min。

2.2 稳定性实验

以葡萄糖醛酸标准溶液作为实验对象，蒸馏水作空白对照，每隔20 min测定吸光度，以检测该方法的稳定性，结果如表4所示。

由表4实验数据可知，在2 h之内，吸光度比较稳定，同时可知该方法对测量时间要求不高，因此对操作人员技术要求不高，方法简单易行。

2.3 精密度实验

以葡萄糖醛酸标准溶液为实验对象，选取最佳实验条件 (具体操作见2.4标准曲线绘制)，进行精密度实验，重复8次进行吸光度测定，由吸光度数据计算得RSD=3.34%，小于5%，说明该方法精密度较好。实验数据如表5所示。

2.4 标准曲线绘制

分别取1.00 mg/mL葡萄糖醛酸标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL置于10 mL容量瓶中，定容后分别取上述各溶液1 mL置于具塞试管中。加入四硼酸钠/硫酸溶液5 mL，振荡使其混合均匀，于沸水浴中加热6 min后冰水浴冷却。加入1.5 mg/mL间羟基联苯溶液120 μL，振荡混匀后超声除去气泡，以蒸馏水作为空白对照样。在524 nm波长处测定吸光度。以标准糖醛酸质量浓度ρ(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线，并拟合求得标准曲线的回归方程为y=11.5222x+0.0259(R2=0.9995)。

图2 葡萄糖醛酸溶液标准曲线

表4 稳定性实验数据结果

表5 精密度实验数据结果

2.5 样品中糖醛酸含量测定

称取 AH1、AH2和 BH1、BH2样品各0.05 g，配置成为0.05 mg/mL溶液，按2.4绘制标准曲线操作。毛竹半纤维素中葡萄糖醛酸质量分数，ρ样为按标准曲线测得的样品中葡萄糖醛酸的质量浓度(mg/mL)，D为稀释因素 (mL)，W样为样品质量 (mg)。

表6 毛竹半纤维素葡萄糖醛酸吸光度及含量

2.6 毛竹半纤维素中糖醛酸含量测定值

按照2.5测定方法测定毛竹半纤维素中糖醛酸含量，以1 mL蒸馏水做空白对照，重复做3次，测定吸光度并根据标准曲线求得其中糖醛酸含量平均值，结果见表6。

表7 重现性实验数据结果

根据表6实验数据可知，毛竹半纤维素A中葡萄糖醛酸含量低于毛竹半纤维素B中葡萄糖醛酸含量。

另以自制毛竹半纤维素BH1溶液为实验对象，选取最佳实验条件，同样测定方法进行操作，测量样品吸光度，并重复8次，根据吸光度数据计算得RSD=2.5%，RSD小于5%，说明该方法重复性较好。实验数据见表7。

3 结语

本实验证明间羟基联苯法能够有效测定碱分级分离提取得到的毛竹半纤维素中葡萄糖醛酸含量，该方法重现性好，精密度高，操作简便、易行。其最佳反应条件为四硼酸钠/硫酸溶液用量为5 mL，间羟基联苯溶液用量为120 μL，沸水浴时间为6 min，显色反应完成后2 h内吸光度变化不大。同时，通过实验可知，分级分离提取的毛竹半纤维素A较半纤维素B葡萄糖醛酸含量更高。

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A Quick Method for Quantitative Determination of Uronic Acid in Hemicellulose of Moso Bamboo

LIN Da*PENG Hong RUAN Rong-sheng YU Zi-ping LIU Yu-huan
(The Engineering Research Center for Biomass Conversion，MOE，Nanchang，Jiangxi Province，330047)

Arabinoglucuronoxylan is the main component in the hemicellulose of moso bamboo．The content of glucuronic acid which is as the main side chain can reflect the structure of the hemicellulose．In this paper，a method for the determination of glucuronic acid in hemicellulose of moso bamboo with m-hydroxydiphenyl was used．The amounts of tetraborate/H2SO4，m-hydroxydiphenyl and the boiling time were studied．This method was proved simple，accurate and reproducible．

hemicellulose;moso bamboo;glucuronic acid;method of m-hydroxydiphenyl

TS749+.3

A

0254-508X(2012)03-0016-04

林 妲女士，在读硕士研究生;研究方向:生物质能源。

(E-mail:lindatt2008@yeah．net)

2011-12-04(修改稿)

本课题得到国家自然科学基金项目 (30960304)资助。

(责任编辑:赵旸宇)