柱前衍生RP-HPLC法同时测定天花粉中天门冬氨酸与谷氨酸的含量

潘健，刘文，陈文秋，余敏灵（乐山市食品药品检验所，四川乐山614000）

柱前衍生RP-HPLC法同时测定天花粉中天门冬氨酸与谷氨酸的含量

潘健＊，刘文，陈文秋，余敏灵#（乐山市食品药品检验所，四川乐山614000）

目的：建立同时测定天花粉中天门冬氨酸与谷氨酸含量的方法。方法：采用柱前衍生反相高效液相色谱法。在碱性条件下，氨基酸与异硫氰酸苯酯反应，生成异硫氰酸苯-氨基酸的衍生物。色谱柱为Venusil-AA氨基酸分析柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相A为0.05mol·L－1醋酸钠溶液（pH 6.5）、B为乙腈-水（80∶20，V/V），梯度洗脱，检测波长为248nm。结果：天门冬氨酸与谷氨酸的进样量分别在12.16～486.40ng（r＝0.9996）与21.08～843.20ng（r＝0.9997）范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系；平均加样回收率分别为98.5%（RSD＝1.43%，n＝9）与98.8%（RSD＝1.19%，n＝9）。结论：本方法简单、准确、、重复性好，可用于天花粉中天门冬氨酸与谷氨酸的含量测定。

柱前衍生；反相高效液相色谱法；天花粉；天门冬氨酸；谷氨酸；含量测定

天花粉为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.或双边栝楼T.rosthornii Harms的干燥根，收载于2010年版《中国药典》（一部）[1]，是一种富含氨基酸的中药材[2]，其中所含的天门冬氨酸与谷氨酸在人体的氨基酸蛋白质代谢中有较重要的作用[3]。因此，测定天花粉中天门冬氨酸与谷氨酸的含量对评价其质量有一定的意义。目前尚无对天花粉中天门冬氨酸与谷氨酸含量进行同时测定的报道，故笔者采用柱前衍生反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对其进行了测定。

1 仪器与试药

2695型HPLC仪，含2487紫外检测器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；Cary100型紫外-可见分光光度计（美国Varian公司）；KQ5200DB型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司，功率：200W，工作频率：40kHz）。

天门冬氨酸、谷氨酸标准品（天津天安药业股份有限公司，批号分别为2009111911、2009112907，含量均≥99.5%）；异硫氰酸苯酯（北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司，批号：AAD06001）；乙腈（上海陆都化学试剂厂，色谱纯）；其余试剂均为分析纯；天花粉（乐山康发药业股份有限公司，批号：1000302、1000509、1000706）。

2 方法与结果

2.1 混合标准品溶液的制备

精密称取天门冬氨酸标准品243.2mg、谷氨酸标准品421.6mg，分置2个200mL量瓶中，加盐酸溶液（0.1mol·L－1）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准品贮备液；精密量取上述贮备液各10mL，置同一100mL量瓶中，加盐酸溶液（0.1mol·L－1）稀释至刻度，摇匀，作为混合标准品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取天花粉（批号：1000302）适量，粉碎后混匀，精密称取3.0618g，置具塞锥形瓶中，分别加80%的甲醇溶液100、100、50、50mL提取4次，每次60℃超声振摇20min，合并甲醇液，水浴蒸干，残渣用盐酸溶液（0.1mol·L－1）溶解并转移至50mL量瓶中，再用盐酸溶液（0.1mol·L－1）稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 样品衍生化

精密量取供试品溶液适量（10～400μL），置1mL量瓶中，加异硫氰酸苯酯-乙腈溶液（1∶80，V/V）200μL，再加三乙胺-乙腈溶液（1.4∶8.6，V/V）稀释至刻度，摇匀，放置1h，转移至试管中，加正己烷1mL，振摇，分取下层液体，滤过，取续滤液作为被测溶液。

2.4 检测波长的选择

取混合标准品溶液100μL，按“2.3”项下方法衍生后，取续滤液于200～400nm波长范围内扫描，发现溶液中2种成分均在248nm波长处有最大吸收，故选择248nm作为检测波长。

2.5 色谱条件

色谱柱：Venusil-AA氨基酸分析柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A：0.05mol·L－1醋酸钠溶液（pH 6.5），流动相B：乙腈-水（80∶20，V/V），梯度洗脱（洗脱梯度见表1）；流速：1.0mL·min－1；检测波长：248nm；柱温：25℃；进样量：10μL。

表1 洗脱梯度Tab 1 Gradient elution

2.6 系统适用性试验

分别取供试品溶液100μL和混合标准品溶液100μL，按“2.3”项下方法衍生后取续滤液，照“2.5”项下色谱条件分别进样测定。结果，供试品色谱中，有与混合标准品色谱中天门冬氨酸和谷氨酸峰相对应的色谱峰，且2个峰与其他色谱峰均有较好的分离度（＞1.5），理论板数均＞3000。另取盐酸溶液（0.1mol·L－1）100μL，按“2.3”项下方法衍生后滤过，作为空白对照溶液，照“2.5”项下色谱条件进样，结果空白对照对样品测定无干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合标准品；B.供试品；C.空白对照；1.天门冬氨酸；2.谷氨酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed standard；B.test sample；C.blank control；1.aspartic acid；2.glutamic acid

2.7 线性关系考察

精密量取混合标准品溶液10、100、200、300、400μL，分别置于1mL量瓶中，按“2.3”项下方法衍生后取续滤液，照“2.5”项下色谱条件进样测定。以氨基酸进样量（c）对峰面积积分值（A）进行线性回归，得天门冬氨酸与谷氨酸的回归方程分别为A＝68224c－113.7（r＝0.9996，n＝5）、A＝62360c－88.5（r＝0.9997，n＝5）。结果表明，天门冬氨酸与谷氨酸的进样量分别在12.16～486.40、21.08～843.20ng范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.8 精密度试验

精密量取混合标准品溶液100μL，按“2.3”项下方法衍生后取续滤液，照“2.5”项下色谱条件连续进样5次。结果，天门冬氨酸的平均峰面积为829600，RSD＝1.6%（n＝5）；谷氨酸的平均峰面积为1314547，RSD＝1.4%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.9 重复性试验

精密量取供试品溶液100μL，共6份，分别置于1mL量瓶中，按“2.3”项下方法衍生后取续滤液，照“2.5”项下色谱条件进样测定。结果，天门冬氨酸的平均含量为0.04‰，RSD＝1.8%（n＝6）；谷氨酸的平均含量为0.11‰，RSD＝1.5%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.10 稳定性试验

取同一供试品溶液100μL，按“2.3”项下方法衍生后取续滤液，照“2.5”项下色谱条件分别于0、2、6、12h进样测定峰面积。结果，天门冬氨酸与谷氨酸峰面积的RSD分别为1.8%与1.5%（n＝4），表明供试品溶液在室温条件下12h内稳定。

2.11 加样回收率试验

取天花粉（批号：1000302）适量，粉碎后混匀，精密称取细粉9份，分别置于具塞锥形瓶中，分别精密加入天门冬氨酸标准品贮备液60、60、60、70、70、70、80、80、80μL和谷氨酸标准品贮备液90、90、90、110、110、110、130、130、130μL，照“2.2”项下方法制备供试品溶液，滤过，取续滤液100μL，按“2.3”项下方法衍生后取续滤液，照“2.5”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2Results of recovery tests（n＝9）

2.12 样品含量测定

取天花粉适量，粉碎后混匀，精密称取粉末约3g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取100μL，置1mL量瓶中，按“2.3”项下方法衍生后取续滤液，照“2.5”项下色谱条件进样测定，代入回归方程计算样品含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果Tab 3 Content determination of samples

3 讨论

在试验中加入正己烷的目的是除去中药材提取和衍生化反应后被测溶液中的脂溶性物质。本方法简单、准确、重复性

好，可用于天花粉中天门冬氨酸与谷氨酸的含量测定。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：52.

[2] 徐国均.生药学[M].北京：人民卫生出版社，1987：409.

[3] 陈琼华.生物化学[M].北京：人民卫生出版社，1991：283.

Content Determination of Aspartic Acid and Glutamic Acid in Trichosanthis Radix by Pre-column Derivatization RP-HPLC

PAN Jian，LIU Wen，CHEN Wen-qiu，YU Min-ling（Leshan Institute for Food and Drug Control，Sichuan Leshan 614000，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of aspartic acid and glutamic acid in Trichosanthis Radix.METHODS：Pre-column derivatization RP-HPLC method was adopted.In alkaline conditions，amino acids reacted with phenyl isothiocyanate to obtain the derivatives of benzene isothiocyanate-amino acid complex.The Venusil-AA amino acid analysis（250mm×4.6mm，5μm）column was used and the detection wavelength was set at 248nm.The mobile phase A was 0.05mol·L－1sodium acetate solution（pH6.5）and the mobile phase B consisted of acetonitrile-water（80∶20，V/V）（gradient elution）.RESULTS：The linear range of aspartic acid was 12.16～486.40ng（r＝0.9996）and that of glutamic acid was 21.08～843.20ng（r＝0.9997）；average recoveries were 98.5%（RSD＝1.43%，n＝9）and 98.8%（RSD＝1.19%，n＝9）.CONCLUSION：This method is simple，accurate and reproducible for the content determination of aspartic acid and glutamic acid in Trichosanthis Radix.

Pre-column derivatization；RP-HPLC；Trichosanthis Radix；Aspartic acid；Glutamic acid；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2012）35-3326-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.22

＊主管药师。研究方向：药物分析。电话：0833-2131877。E-mail：panjian38@163.com

#通讯作者：副主任药师。研究方向：药物分析。电话：0833-2131876。E-mail：89729204@qq.com

2011-09-07

2011-12-15）