LC-MS法同时测定骨康胶囊中6种主要成分的含量

杨洁芳（重庆市第九人民医院药剂科，重庆 400700）

LC-MS法同时测定骨康胶囊中6种主要成分的含量

杨洁芳＊（重庆市第九人民医院药剂科，重庆 400700）

目的：建立同时测定骨康胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素和异补骨脂素含量的方法，为骨康胶囊质量评价提供依据。方法：采用液相色谱-质谱联用技术。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-水（梯度洗脱），分析时间为30min。采用电喷雾离子源正离子模式，通过选择离子监测（SRM）模式同时监测复方中6种成分及内标。结果：6种成分线性回归方程的r值均≥0.9960，平均加样回收率范围为96.21%～101.82%，RSD范围为2.23%～4.07%（n均为6）。骨康胶囊中6种主要成分，特别是川续断皂苷Ⅵ在不同批次间含量很不均一。结论：本方法简便、灵敏度高、专属性好，适用于骨康胶囊的质量评价；有必要制定严格的成分含量合格标准以便科学评价骨康胶囊的质量。

骨康胶囊；液相色谱-质谱联用技术；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1；川续断皂苷Ⅵ；补骨脂素；异补骨脂素；含量测定

骨康胶囊是由芭蕉根、炸酱草、补骨脂、续断和三七组成的中药复方制剂，具有滋补肝肾、强筋壮骨、通络止痛的功效，用于治疗骨折、股性关节炎、骨质疏松症属肝肾不足、经络瘀阻者。为有效控制该产品质量，保证临床用药安全、有效，本试验拟采用液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术同时测定骨康胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素和异补骨脂素6种主要成分的含量，以期为骨康胶囊的质量控制提供一种选择性强、灵敏、准确的检测方法。

1 仪器与试药

2695高效液相色谱系统、Micromass ZQ2000MS检测仪、Masslynx 4.1色谱工作站（美国Waters公司）；AE240电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；高速低温离心机（美国Thermo公司）；KQ-3200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率：40kHz，功率：120W）。

骨康胶囊（贵州维康药业有限公司，规格：4g/粒，批号：20110502、20100509、20100705）；三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、多潘立酮对照品（中国食品药品检定研究院，批号 分 别 为 110745-200617、110703-200323、110704-200217、100304-2005027）；川续断皂苷Ⅵ标准品（上海雅吉生物有限公司，批号：MUST-11121501，含量＞98%）；补骨脂素、异补骨脂素标准品（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为091019、091104，含量均＞98%）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，上海化学试剂有限公司）；超纯水（美国Millipore公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取本胶囊1粒，将内容物转移至10mL玻璃管中，加入6mL甲醇，超声提取30min，3500r·min－1离心10min，吸取上清液，以流动相稀释至适当倍数，12000r·min－1离心10min，所得上清液即为供试品溶液。

2.2 对照品贮备液的制备

精密称取对照（标准）品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素和多潘立酮（内标）分别为5.38、5.27、5.08、5.30、10.07、9.98、8.3mg，分别置于7个10mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀。将除多潘立酮外的其余6种对照（标准）品溶液各自稀释若干倍后进行混合，得到含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素和异补骨脂素浓度依次为0.269、2.148、2.032、0.265、0.998、1.007μg·mL－1的混合对照品贮备液；将多潘立酮对照品溶液稀释至适当倍数得到终浓度为0.166μg·mL－1的内标贮备液。各贮备液置于4℃冰箱中保存，备用。

2.3 LC-MS分析条件

2.3.1 LC条件色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5μm）；柱温：（25±5）℃；流速：0.25mL·min－1；进样量：8μL；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～16min，60%A；16～16.5min，60%→95%A；16.5～29min，95%A；29～30min，95%→60%A）；柱平衡时间：6min。

2.3.2 MS条件 采用电喷雾离子源正离子模式，选择离子流监测（SRM）模式采集数据；脱溶剂气流量：400L·h－1；脱溶剂气温度：350℃；锥孔气流量：35L·h－1；离子源温度：120℃；毛细管电压：3.2kV。6种对照品的主要MS参数信息见表1；SRM色谱图见图1。

表1 6种对照品和内标的主要MS参数信息Tab 1 Main mass parameters of 6chemical standards and internal standard

图1 SRM色谱图A.混合对照品；B.供试品（批号：20110502）；1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rb1；3.人参皂苷Rg1；4.川续断皂苷Ⅵ；5.补骨脂素；6.异补骨脂素；IS.多潘立酮Fig 1 SRM chromatogramsA.mixed control；B.test sample（lot No.20110502）；1.notoginsenoside R1；2.ginsenoside Rb1；3.ginsenoside Rg1；4.asperosaponin Ⅵ；5.psoralen；6.isopsoralen；IS.domperidone.

由图1可见，在上述LC-MS分析条件下，混合对照品溶液和供试品溶液中各成分的SRM图谱色谱峰峰形良好，基本无杂质峰干扰，表明该分析条件具有较好的分离度和灵敏度，可满足对骨康胶囊中各成分定量的要求。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的制备 精密量取混合对照品贮备液适量，以其作为混标最高浓度溶液HB1，并用甲醇对其进行倍比稀释，依次获得系列混标溶液HB2～HB7。分别精密吸取系列混标溶液各320μL，加入内标贮备液80μL，涡旋混匀后按上述LC-MS分析条件进样测定，记录峰面积。以待测成分峰面积和内标峰面积的比值（y）为纵坐标，对照品浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，并进行一元线性回归，得标准曲线方程，结果见表2。

表26 种对照品的标准曲线方程Tab 2Linear relationships of 6compounds

2.4.2 精密度试验 取混标溶液HB4适量，连续进样6次，计算各色谱峰相对峰面积（待测成分峰面积/内标峰面积）的RSD。结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素相对峰面积的RSD分别为2.4%、1.2%、1.2%、1.9%、3.5%、2.5%（n均为6），表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一批（批号：20110502）供试品溶液的1000倍稀释液适量，分别于0、2、4、6、8、12h进样测定。结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素相对峰面积的RSD分别为2.1%、3.1%、2.9%、0.6%、4.7%、4.1%（n均为6），表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批（批号：20110502）骨康胶囊适量，共6份，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，取其1000倍稀释液进样测定。结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素相对峰面积的RSD分别为1.4%、1.6%、2.1%、1.1%、2.7%、0.7%（n均为6），表明本方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密量取同一批（批号：20110502）骨康胶囊提取液1000倍稀释液（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素的质量浓度分别为0.1069、0.6392、0.4046、0.0414、0.1318、0.1339μg·mL－1）适量，共6份，按检出量精密加入等体积的混标溶液HB4，照“2.1”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算加样回收率。结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素的平均加样回收率分别为99.37%、99.97%、101.44%、101.82%、101.30%、96.21%，RSD分别为2.72%、2.23%、2.53%、4.07%、3.71%、3.35%（n均为6）。

2.5 样品含量测定

取3批骨康胶囊，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，取其1000倍稀释液进行LC-MS分析，每批重复测定3次，按标准曲线方程计算6种成分的含量，并将其按稀释倍数换算成每粒胶囊（4g）中的含量，结果见表3。

3 讨论

本试验中检测成分的选择依据2010年版《中国药典》规定的复方中各种药材的主要成分制定[1]。

LC-MS联用技术结合了LC的高分离效能和MS的高选择性、高灵敏度的特点，其SRM离子检测模式可以在不需完全分离的情况下实现多个组分的同时测定，因而在复方制剂多成分含量测定中具有传统LC-UV方法不可比拟的优势[2，3]。方法学考察结果表明，本方法线性关系、精密度、重复性、加样回收率等均能满足定量分析要求，可以准确地同时测定骨康胶囊中6种主要成分的含量，评价骨康胶囊的质量。

样品含量测定结果表明，不同批次样品间各主要成分的含量存在不同程度的差异，其中川续断皂苷Ⅵ在批号为20100509和20100705的骨康胶囊中仅有微量存在，与批号为20110502样品中的含量相差甚选。这表明不同批次骨康胶囊间存在明显的质量差异，可能会对其药理作用的发挥产生一定的影响。因此，有必要制定严格的成分含量合格标准，以确保骨康胶囊的质量和疗效的可控性。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：11、174、309.

[2] 邵清松，胡润淮.HPLC-MS联用技术在中药指纹图谱研究中的应用[J].中国药房，2007，18（12）：938.

[3] 秦 枫，于生兰，高彦慧，等.HPLC-MS/MS法同时测定三七须根总皂苷中人参皂苷Rg1和Re的含量[J].中国药房，2010，21（31）：2922.

Simultaneous Determination of 6Mail Components in Gukang Capsules by LC-MS

YANG Jie-fang（Dept.of Pharmacy，Chongqing Ninth People’s Hospital，Chongqing 400700，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1，asperosaponinⅥ，psoralen and isopsoralen in Gukang capsules.METHODS：LC-MS method was adopted.The separation was performed on Agilent Zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-water（gradient elution）.The detection time was 30min.The quantitative analysis of 6components and internal standard was performed using mass spectrometry with electrospray ionization（ESI）interface in positive selective reaction monitoring（SRM）mode.RESULTS：The average recoveries of 6components were 96.21%～101.82%（r≥0.9960）.The variations of RSD ranged from 2.23%to 4.07%（n＝6）.The contents of 6components in Gukang capsules，especially Asperosaponin Ⅵ，varied largely.CONCLUSION：The method is simple，sensitive and specific，and it is suitable for the quality evaluation of Gukang capsules；it is necessary to formulate strict content standard for the scientific quality evaluation of Gukang capsules.

Gukang capsules；LC-MS；Notoginsenoside R1；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Rb1；Asperosaponin Ⅵ；Psoralen；Isopsoralen；Content determination

R283.65；R927.2

A

1001-0408（2012）35-3344-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.29

＊副主任药师。研究方向：医院药学。电话：023-68251325。E-mail：1605038137@qq.com

2012-02-06

2012-07-30）