长效土霉素注射液在猪体内的药动学及相对生物利用度研究

廖雪玲，张炳旭，丁焕中

(1.上海公谊兽药厂，上海 201401;2.华南农业大学兽医学院，广州 510642)

四环素类抗生素用于治疗感染性疾病已有半个世纪。由于口服给药的方便性，四环素类抗生素临床实践具有广泛的使用性[1]。此类抗生素是通过抑制蛋白质的合成来抑制细菌生长，其机制是药物与细菌30s亚基核糖体结合，从而阻止氨基酰-tRNA结合到核糖体的A位点，进而阻止氨基酸多肽链的合成[2]。

土霉素为四环素类广谱抗生素，20世纪50年代开始用于临床，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、衣原体、霉形体、螺旋体、放线菌和某些原虫皆有抑制作用[3]。土霉素不仅广泛用于畜禽，还有少数被批准用于水产的抗生素，疗效显著[4]。美国于20世纪80年代推出长效土霉素注射液，抗菌效果显著延长。近年来国内也有长效土霉素注射液相关研究，报道了不同溶媒的土霉素注射液在动物体内的药代动力学特点[5]。本文对一种长效土霉素注射液在猪体内的药动学和相对生物利用度进行研究，以期为临床合理使用该剂型提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 试剂和药品 30%长效土霉素注射液，批号071012，上海公谊兽药厂。20%长效土霉素注射液，批号70453009E，美国辉瑞(动物保健品)有限公司。土霉素标准品，购自中国兽医药品监察所，批号H010105。EDTA·2Na、草酸、三氟乙酸、柠檬酸、高氯酸、85%磷酸、磷酸氢二钠等均为国产分析纯试剂。甲醇、乙腈均为色谱纯，DIMA TECHNOLOGY INC。超纯水为符合 GB/T6682规定的二级水。

1.2 仪器 高效液相色谱仪:Waters 2695分离系统、在线负压脱气机、2487紫外检测器，配备四元泵、脱气泵、色谱工作站、自动进样器和柱温箱，美国Waters公司。色谱柱:Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，不锈钢柱，大连依利特公司。电子分析天平，FA2004N型，上海精密科学仪器有限公司。台式高速离心机，Centrifuge5804，德国 EPPENDORF公司。旋涡混合器，XW-80A，上海青浦沪西仪器厂。可调微量移液器，Eppendorf Research型，10 ～100 μL，20 ～200 μL，100 ～1000 μL，500 ～5000 μL，德国 EPPENDORF 公司。

1.3 试验动物 健康长白×大白×杜洛克三元阉公猪(landrace×large white×duroc)7头，50日龄，体重(19.17±2.15)kg。自由采食、饮水，饲喂不加任何抗菌药物的全价配合饲料。

1.4 给药及采样 动物按随机交叉试验设计进行分组。按20 mg/kg体重单次颈部肌肉注射30%长效土霉素注射液和对照土霉素注射液 (市售美国辉瑞20%长效土霉素注射液)。给药前测定两种制剂的药物含量。给药前采取空白血浆，给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、168、192 h 分别经前腔静脉采集血液样品，每次采血5 mL左右，分离血浆，-20℃保存待测。

1.5 样品处理 样品解冻，摇匀。准确吸取1.0 mL血浆，加入200 μL的变性剂(EDTA-Mcllvaine缓冲液和高氯酸的混合液，体积比4∶1)，漩涡30 s，混匀，静置5 min后12000 r/min离心15 min，吸取上清液经0.22 μm针式滤膜过滤，取50 μL滤液进行高效液相色谱分析。

1.6 色谱条件 流动相:A液(含0.6 mmol/L EDTA·2Na，10 mmol/L 草酸，0.15%三氟乙酸)∶B液(乙腈)=70∶30(V/V);色谱柱:Hypersil BDS C18不锈钢柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);进样量20 μL;流速1.0 mL/min;柱温35℃;紫外检测波长357 nm。

1.7 回收率和变异系数 将定量的标准液加入猪空白血浆中，配得低(0.1 μg/mL)、中(0.5 μg/mL)和高(2 μg/mL)三个样品浓度，按1.5项样品处理方法处理样品，进行HPLC测定;同时分别取浓度为0.1、0.5、2 μg/mL土霉素标准系列溶液1 mL进行HPLC测定，每一浓度样品重复5次，以峰面积比计算，求其回收率。每批(日内)作5次重复，共作5个批次(日间)。计算每批内和每批间的色谱峰面积平均值及标准误，求得各变异系数。

1.8 标准曲线和线性范围 在2 mL的离心管中各加入1 mL空白血浆，再依次加入20 μL土霉素系列浓度(2.5～500 μg/mL)，旋涡混匀，使得各样品中血浆的药物浓度为0.05～10 μg/mL，按1.5项样品处理方法处理样品，进行HPLC测定。以土霉素色谱峰面积(A)为横坐标，药物浓度(C)为纵坐标，绘制标准曲线，求得标准曲线回归方程和相关系数。

1.9 样品测定及数据处理 给药后不同时间点采集的血浆样品经处理后，进行HPLC测定。以测得样品中药物峰面积代入标准曲线，计算药物浓度。所得药物浓度-时间数据采用MCPKP药动学计算机程序处理，计算出每头动物的药动学参数，然后计算平均值及标准差。

2 结果

2.1 色谱条件适用性 在本试验色谱条件下，土霉素与其他组分分离良好，色谱峰峰形较佳，测得土霉素保留时间为6.2 min左右。

2.2 回收率和变异系数 按上述处理方法，在0.1、0.5、2.0 μg/mL 浓度下，平均回收率在(77.4±2.3)% ～(96.4±2.4)%之间，批内和批间变异系数均不超过10.00%。由此可知，此血浆处理方法和液相检测方法可靠，重复性好。

2.3 标准曲线和线性范围 血浆中土霉素线性回归方程为 C=0．000042A-0．0144(r=0.9999)，线性范围为0.05～10 μg/mL。按信噪比S/N=3为检测限(LOD)，S/N=10为定量限(LOQ)，求得本方法测定血浆中土霉素检测限为0.02 μg/mL，定量限为0.05 μg/mL。

2.4 血药浓度和主要药动学参数 30%长效土霉素注射液与20%长效土霉素注射液药动学试验的血药浓度和主要药动学参数见表1和表2。土霉素在猪体内符合一级吸收二室模型。

表1 30%长效土霉素注射液与20%长效土霉素注射液给药后的血药浓度 μg/mL

续表

表2 30%长效土霉素注射液与20%长效土霉素注射液给药后的主要药动学参数(x±s)

3 讨论

猪肌肉注射30%长效土霉素注射液后吸收迅速(吸收半衰期为0.088 h，达峰时间为0.609 h)，峰浓度高(4.956 μg/mL)，消除半衰期长(52.499 h)，有效血药浓度维持时间长(给药后72 h平均血药浓度约为0.3 μg/mL)，相对生物利用度高(105.368%)。生物学统计结果表明(t检验)，与20%长效土霉素注射液相比，30%长效土霉素注射液给药后主要药动学参数(吸收半衰期、消除半衰期、峰浓度、达峰时间、药-时曲线下面积)无显著差异。

本试验长效土霉素注射液在猪体内消除半衰期(t1/2β)为52.499 h，这与之前报道长效土霉素注射液在猪体内的消除半衰期(t1/2β)大致相符[6-7]。另外，长效土霉素在其他种类动物消除半衰期(t1/2β)为:山羊，15.1 h;绵羊，14.4 h;犊牛，23.9 h;奶牛，6.964 h(乳汁);奥尼罗非鱼，60.312 h;班节对虾，23.372 h[8-11]。由此可见，长效土霉素药动学特征虽存在种属差异性，但半衰期都相对延长，具有长效特点，这与土霉素使用的有机溶媒有关。早有研究报道，使用α-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺为溶媒的土霉素注射液明显具有长效性[12]。

本试验按20 mg/kg体重给药后，72 h平均血药浓度约为0.3 μg/mL，高于猪的常见敏感菌MIC。因此，对于临床敏感菌感染，建议30%长效土霉素注射液按20 mg/kg体重剂量3～4 d给药1次，连续给药2次，重症酌情加倍。

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