吉林白鹅α干扰素基因的原核表达及抗血清的制备

李公美，胡静涛，李玉梅，李茂辉，闫金明，刘可越，钱爱东

(1.吉林农业大学动物科技学院，长春 130118;2.吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062;3.吉林正大实业有限公司，长春 130033;4.九江学院，江西九江 332000)

干扰素(interferon，IFN)是在特定的诱导剂作用下由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白，能使机体迅速获得抗病毒和抗肿瘤等多方面功能[1]。IFN根据其细胞来源、生化特性及生物学活性差异，将干扰素分为两大类:I类(IFN-α、IFN-β、IFN- ω 和 IFN- ζ)和 II类(IFN- γ)[2]，I型干扰素主要由病毒和微生物诱导产生，Ⅱ型干扰素主要由淋巴细胞受有丝分裂原或特异性抗原刺激产生。IFN-α可抑制感染细胞中病毒mRNA翻译，并促使病毒mRNA降解，提高细胞表面MHC I类分子的表达水平，有助于向T细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解，并可增强NK细胞对病毒的杀伤能力[3]。

养鹅业是我国养殖业中重要的支柱产业，许多病毒性疾病(如鹅细小病毒、鹅副粘病毒等)仍严重危害养鹅业。目前该类疾病的防治相对较落后，由于干扰素具有调节机体的体液免疫反应和细胞免疫反应，增强机体对细菌、寄生虫和病毒感染的抵抗力，所以对其进行研究一直是细胞因子研究方面的重点之一。1994年，Sekellick等首次成功克隆和表达ch IFN-α基因并进行结构分析。1995年Schultz等[4]报道了鸭干扰素，并开展了鸭基因工程干扰素抗病毒的研究，Quere等[5-6]利用基因工程技术生产的重组gIFN-ɑ在禽病毒性疾病的临床治疗中得到了初步应用，而大肠杆菌作为基因工程表达系统，具有操作简单、生产周期短、成本低、产量高等优点，因此本研究旨在利用大肠杆菌建立高效gIFN-ɑ体外表达体系，同时制备兔抗鹅IFN-ɑ多克隆抗血清，为gIFN-ɑ的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒与毒株 鸭瘟病毒由吉林农业大学教育部动物生产及产品质量安全重点实验室保存，含吉林白鹅IFN-α(JL-G-IFN-α)基因重组质粒pMD-T-IFN-α由本实验室构建，E．coli BL21(DE3)、pGEX-6p-1由吉林大学兽医研究所馈赠。

1.2 主要试剂 限制性内切酶BamH I、EcoR I、Taq DNA聚合酶及T4 DNA连接酶等均来自宝生物工程(大连)有限公司;IPTG、DNA分子质量标准、质粒DNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收纯化试剂盒为杭州维特洁生物技术有限公司产品;酵母浸出粉、胰蛋白胨为Oxoid公司产品;DMEM培养基、小牛血清，Invitrogen公司。GST融合蛋白纯化试剂盒为Amersham Pharmacia公司产品，低分子质量蛋白质标准、预染蛋白质分子量标准为北京天根有限公司产品。

1.3 引物设计与目的基因PCR扩增 根据Gen-Bank上已发表的灰雁 IFN-ɑ序列(登录号:HQ009755)，用Primer 5.0软件在其完整的阅读框架外设计上、下游引物，引物序列分别为P1:5'AT->AGGATCCAACATGCCTGGGCCATCAG 3';P2:5'TCCGAATTCTTAGCGCATGGTGCGG 3'，划线部分分别为BamH I和EcoR I酶切位点，引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.4 鹅IFN-α基因的PCR扩增及扩增产物回收

以重组质粒pMD-T-IFN-ɑ为模板，PCR扩增IFN-ɑ，PCR 反应体系:ddH2O 37.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、mix dNTPs(10 mmol/L)1 μL、IFN- ɑ P1(20 pmol/L)/IFN-ɑ P2(20 pmol/L)各1 μL、重组质粒 JL-GoIFN-α(0.5 mg/mL)1 μL、ExTaq酶(5 u/μL)0.5 μL，补超纯 50 μL，混匀。PCR 反应条件为:95℃预变性8 min，94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环后，72℃延伸10 min，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应产物，用凝胶回收纯化试剂盒回收目的片段。

1.5 重组表达载体pMD-IFN-ɑ的构建 用BamH I和EcoR I双酶切含鹅IFN-α基因T载体，插入到同样经 BamH I和 EcoR I双酶切的pGEX-6p-1表达载体的大片段中，构建重组质粒pGEX-IFN-ɑ。转化、筛选阳性克隆，提取重组质粒进行PCR和BamH I、EcoR I酶切鉴定，对初步筛选出的阳性克隆送至宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.6 重组质粒pGEX-IFN-ɑ的诱导表达及鉴定

将鉴定正确的重组质粒pGEX-IFN-ɑ转化至表达宿主菌BL21中，挑单个菌落接种于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃、200 r/min摇床培养。待菌液OD值为0.6～1.0时，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，30℃诱导培养6 h后收集菌体，同时设只含表达载体pGEX-6p-1的BL21和诱导后pGEX-6p-1的BL21对照。将诱导表达菌裂解产物进行SDS-PAGE和Western-blot。

1.7 重组鹅IFN-α纯化 根据谷胱甘肽琼脂糖-4B(Glutathione Sepharose-4B)操作说明书纯化GST融合蛋白:(1)将谷胱甘肽琼脂糖-4B基质转移至一次性的小柱子;(2)轻扣小柱以除气泡，然后让谷胱甘肽琼脂糖-4B基质着床;(3)移去底盖;(4)加入10倍体积的1×PBS洗涤2次;(5)在基质中每次加入100 μL GST reduction elution buffer洗脱GST融合蛋白;(6)收集洗脱液。用SDSPAGE电泳检查纯化蛋白的纯度，蛋白的浓度用BCA蛋白检测试剂盒确定。

1.8 多克隆抗血清的制备 将1 mL纯化蛋白(含目的蛋白0.25 mg/mL)加入1 mL弗氏完全佐剂中制成油乳剂，颈背部皮下多点注射免疫2月龄新西兰白兔(由吉林大学实验动物中心提供);首免后14 d和28 d分别用纯化蛋白1 mL(含目的蛋白0.25 mg/mL)加入弗氏不完全佐剂进行第二次和第三次加强免疫，第三次免疫后10 d于心脏中采血处死兔子，按常规方法采血分离血清。将制备的血清按 1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400、1 ∶800、1 ∶1600、1 ∶3200、1 ∶6400、1 ∶12800、1 ∶25600、1 ∶51200 稀释，以正常兔血清为阴性对照，与1∶100稀释的纯化的鹅IFN-ɑ按常规方法进行ELISA检测[7]。

2 结果

2.1 重组质粒pGEX-IFN-ɑ的鉴定 对重组质粒pGEX-IFN-ɑ进行PCR鉴定，结果在约570 bp处得到了1条目的条带;用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，分别在约4900 bp和约570 bp处出现1条带(图1)，与预期结果相符。将经PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒测序，测序结果与鹅IFN-ɑ全基因的编码序列完全一致。

图1 重组质粒pGEX-IFN-α的鉴定

2.2 重组鹅IFN-ɑ基因的表达及鉴定 SDSPAGE电泳结果显示，含有重组质粒pGEX-IFN-ɑ的重组菌液出现1条约为43.0 ku处的融合蛋白(GST-IFN-ɑ)，与预期结果相一致;而只含表达载体pGEX-6P-1的BL21，在26.0 ku处有1条明显的蛋白带(GST);未含重组质粒和表达载体的宿主菌BL21，没有出现这一条带(图2)。表明重组质粒pGEX-IFN-ɑ在BL21中可诱导表达重组鹅ɑ干扰素融合蛋白。薄层扫描分析结果显示，表达蛋白占菌体总蛋白的25%。SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素(NC)上，用GST单抗作一抗，辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG作二抗进行Western blot检测。结果(图3)显示，融合蛋白43.0 ku处出现一条特异条带，同时表达空载体在26.0 ku处出现一条带，因此根据分子质量的大小推测，这条带的相对分子质量与目的蛋白的相对分子质量相同，表明诱导表达的目的蛋白是重组的鹅ɑ干扰素。将目的蛋白直接置于去离子水中透析复性，复性率约为62%。

2.3 重组鹅IFN-ɑ的抗血清测定 用纯化的重组gIFN-ɑ作为包被抗原，对制备的兔高免血清进行ELISA检测，结果表明，gIFN-α多克隆抗血清的抗体效价达1∶50000。

3 分析讨论

干扰素具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。由于病毒病一直困扰着我国的养鹅业，造成了巨大的经济损失，因此养鹅业生产中需要干扰素类广谱抗病毒生物制剂来治疗和加强疫苗的免疫效果。干扰素存在种属特异性，虽然克隆到的DuIFN-Ⅰ基因与鸡、哺乳动物和人干扰素基因的同源性较低，但半胱氨酸残基却具有保守性。克隆到的DuIFN2Ⅰ基因存在着2个糖基化位点，这表明它与人和鸡的Ⅰ型干扰素基因一样，也是一种糖蛋白。夏春等[8]从鸭肝组织中提取基因组克隆到DuIFN-ɑ基因，Schultz等[4]报道了鸭干扰素，并开展了鸭基因工程干扰素抗病毒的研究，在1995年从HindⅢ消化的鸭基因组DNA中，用ChIFN-ɑ基因探针克隆了包含DuIFN-α基因的HindⅢ片段(2.7 kb)，分别在大肠埃希氏菌和COS细胞中完成了表达，并在鸭肝细胞体外培养系统中证实了其抗DHBV的能力。对人IFN的研究表明[10-11]，IFN除具有抗病毒活性外，还具免疫调节作用。Hurchen GUO 等[12]利用 pcDNA3.1/IFN-ɑ增强了FMD DNA疫苗的效果，该研究表明IFN-α作为佐剂的使用具有良好的应用前景，因此对鹅IFN-ɑ成熟片段表达产物高效纯化，获得高效价多克隆抗体，为研究机体的免疫状态及免疫机制奠定了基础。

本实验选用的是pGEX-6p-1，它是一种高效诱导的原核表达载体，所表达的目的蛋白可避免宿主菌蛋白酶的水解作用，纯化方便，用特异性的蛋白酶可以从所表达的融合蛋白中切下目的蛋白质或多肽;并且选用了适合于GST融合表达系统的宿主菌BL21(DE3)PlysS，该菌种缺少在细胞膜外的蛋白酶ompT的基因，还缺少多种蛋白酶，降低了重组产物表达后被细胞降解或剪切的概率。

本实验中，经低温诱导进行优化条件表达的蛋白始终以包涵体形式存在，尽管包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主菌毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低，这大大增加了基因工程产品的制造成本，本研究采用了谷胱甘肽-琼脂糖柱进行亲和层析纯化，得到了较纯的融合蛋白，在得到纯化的目的重组蛋白后，直接在纯水中透析，去除变性剂，方法简单，且得到较高的复性率。

本实验成功构建正确的重组质粒pGEX-6p-1/gIFN-α转化BL21(DE3)，经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析发现在43 ku处表达出了一条特异的融合蛋白带，分子量与所推测的gIFN-α大小相符，蛋白产量约占菌体总蛋白的25%。在获得复性后的gIFN-α后，对新西兰兔进行了三次免疫，制备的多克隆抗血清抗体效价达到1∶50000。本实验成功克隆表达、纯化了gIFN-α重组蛋白，并获得了兔抗gIFN-α多克隆抗血清，为重组鹅干扰素的临床应用打下了基础。

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