蛋鸡肝细胞分离及制备方法的优化

周筱丹，董晓芳，佟建明，徐 鹏

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室，北京 海淀100193）

肝脏是家禽脂类代谢的主要器官，因此蛋鸡肝细胞的分离和培养对脂类代谢的研究具有重要意义。目前肉鸡［1］的肝细胞培养方法已较为成熟。由于蛋鸡的解剖结构与肉鸡有明显的差异，采用离体灌流法制备的肝细胞活率低［2］。因此离体灌流法还无法代替体内灌流法。本试验通过对现有成年鸡肝脏体内灌流方法［1］进行优化，为获得更多高质量的肝脏细胞，提供更为合理的细胞分离和制备方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料 用于原代肝细胞培养的蛋鸡，购自北京延庆康庄鸡场。选择健康的25周龄海蓝褐产蛋鸡12只，分为2个处理，分别采用两种肝细胞分离和制备方法，每个处理6个重复。

1.2 主要试剂 Williams′medium E细胞培养液、人胰岛素、地塞米松、人转铁蛋白、青霉素、链霉素和抗坏血酸，均购自Sigma公司；新生牛血清为Invitrogen公司生产；台盼蓝、肝素钠、戊巴比妥钠等为国药集团化学试剂有限公司生产；6孔细胞培养板为Corning公司生产。

1.3 蛋鸡肝细胞的制备 于灌流前蛋鸡禁食8h，翅静脉注射4～5mL肝素钠（1 400UI／mL）抗凝，腹腔注射5～10mL戊巴比妥钠（50mg／mL体重）麻醉。待鸡完全麻醉后，用38℃新洁尔灭溶液全身浸泡消毒，将消毒好的鸡放入超净台，仰卧固定在手术台上，从腹部中间起始，拨开腹部和胸部皮肤；沿胸骨两侧第一根肋骨剪断，打开胸腔和腹腔，轻轻将肠道拉向躯体左侧，结扎输卵管静脉和胰十二指肠静脉后，在肠系膜后静脉下穿2条棉线，结扎远心端棉线，近心端棉线暂不结扎；在2条棉线之间用眼科剪将肠系膜后静脉剪开小口，沿肝门静脉方向插入小鼠灌胃针，并用近心端棉线结扎固定好小鼠灌胃针。以30mL／min的速度灌注37℃预热的无菌灌流液 A （HEPES：10mmol／L，NaCl：137mmol／L，KCl：3mmol／L，Na2HPO4·12H2O：3mmol／L，EDTA二钠盐：5mmol／L；pH 值为7.4），待肝脏臌胀变为土黄色时剪开上腔静脉，持续9min，随后以30mL／min灌注37℃预热的无菌灌流液B（HEPES：10mmol／L，NaCl：137mmol／L，KCl：3 mmol／L，Na2HPO4·12H2O：3mmol／L；pH 值为7.4），持续10min；待流出的液体变清后，进行消化灌流，即以20mL／min灌注40℃预热的无菌灌流液C（HEPES：10mmol／L，NaCl：137mmol／L，KCl：3 mmol／L，Na2HPO4·12H2O：3mmol／L，Ⅱ型胶原酶：0.4g／L和 CaCl2：5.4mmol／L；pH 值为7.4），15min后肝脏塌陷，消化完毕［1］。

1.4 原有的成年鸡肝细胞培养灌流法［1］灌流前将蛋鸡血管仅结扎肠系膜后静脉远心端，输卵管静脉和胰十二指肠静脉不结扎。

1.5 肝细胞的分离 以肝脏先臌胀变土黄色随后变塌陷松软为肝脏灌流是否成功的标志。触动肝脏表面松软后，摘取消化好的肝脏，放入无菌平皿中，加入基础培养液（Williams′medium E细胞培养液含10%新生牛血清），剔除血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分；用镊子撕开肝脏包膜，肝细胞大量流出，用大口径吸管轻轻吹打，随后分别过100目、200目及400目细胞筛，所得肝细胞悬液用基础培养液清洗，并500r／min离心5 min，弃上清后，沉淀用基础培养液再清洗1次，离心（500r／min，5min）弃上清。用贴壁培养液重悬（Williams′medium E细胞培养液含10%新生牛血清、1μmol／L 人胰岛素、1μmol／L 地塞米松、10 μg／mL人转铁蛋白、10μg／mL抗坏血酸和1%青霉素、链霉素）。

1.6 细胞计数和活率检测 台盼蓝拒染法检测细胞活力，吸取100μL细胞悬液与0.4%台盼蓝1∶1等体积混合均匀，用血细胞计数板计数。计算出制备出的肝细胞数量和活率。计算公式：

细胞活率（%）＝ 未染色的细胞数目／（未染色的细胞数目＋染色的细胞数目）×100%［19］。

1.7 蛋鸡肝细胞的原代培养 细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为5×105个／mL，接种于6孔细胞培养板，每孔接种2mL细胞悬液，在37℃、5%CO2的培养箱内培养4h，细胞贴壁后换用无新生牛血清的 Williams′medium E。继续培养，以后每24h更换一次培养液。

1.8 蛋鸡肝细胞培养基上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的测定 细胞换液前，分别于4、24、48、144、168h收集6孔细胞培养液，以4℃12 000r／min，离心10min，取上清保存在－20℃冰箱，待测LDH活力。具体操作方法按照南京建成生物工程有限公司生产的LDH测定试剂盒说明书进行。将0.05 mL待测样本与基质缓冲液1∶5混合，加0.05mL NADH 混匀，37℃水浴15min，加0.25mL 2，4－二硝基苯肼37℃水浴15min，加0.4mol／L NaOH溶液2.5mL，室温放置3min，440nm蒸馏水调零1cm光径测吸光度。

1.9 统计分析 采用SAS（8.02）软件的 ANOVA程序进行方差分析，用Duncan′s法进行差异显著性检验。试验结果表示为“平均值±标准差”。

2 结果

2.1 不同方法下肝脏灌流成功率、肝细胞数量和细胞活率比较 采用本方法分离蛋鸡肝脏细胞，6次试验均灌流成功，肝脏灌流成功率达到100%，采用原有的成年鸡肝细胞培养灌流法，6次试验仅灌流成功2次，肝脏灌流成功率仅为33.3%。由表1可知，本方法培养的肝细胞通过细胞计数，计算出从每个肝脏获得的肝细胞数量为（1.09±0.21）×109个，肝细胞数量是采用原有方法的122倍。经台盼蓝拒染法检测细胞活率，本方法所获得的肝细胞活率比采用原有方法提高了17.4%。

表1 不同方法下肝细胞数量和细胞活率比较

2.2 不同方法下肝细胞培养基上清液中LDH活力的测定 不同肝细胞培养灌流法分离的肝细胞培养基上清液中LDH的测定结果，见表2。由表2可知，本方法和原有方法制备的肝细胞，其培养基上清液中LDH活力在4、24、48、144h和168h无显著差异（P＞0.05）。

表2 培养基上清液中的LDH的活力的测定 （U／L）

3 讨论

3.1 不同方法下肝脏灌流成功率、肝细胞数量和细胞活率比较 原有的成年鸡肝细胞制备方法多以肉鸡和种公鸡作为试验动物［3］，采用结扎肠系膜后静脉的两步原位灌流法制备肝细胞，取得了良好的效果。但这一分离方法在蛋禽肝细胞的制备上并不适用，肝脏灌流成功率太低是其不适用的主要原因。与肉鸡和种公鸡不同，蛋禽具有发达的输卵管静脉丛，输卵管静脉与肝门静脉相通，因此按原有的成年鸡肝细胞培养灌流法会极易导致灌流液无法完全进入肝脏，肝脏不能与灌流液充分接触导致灌流失败。肝脏灌流是肝细胞分离技术最重要的环节，灌流的成功与否直接影响肝细胞制备的数量和存活率。通过两种方法的对比试验，可知本方法可以保证较高的成功率，肝细胞数量和活率也保证试验的需求。

3.2 不同方法下肝细胞培养基上清液中LDH活力的测定 LDH存在于肝细胞内，当细胞膜破损时大量的LDH从细胞内泄露出来。细胞培养液中的LDH的活力，常是用来指示细胞的损伤程度，反应了细胞膜的完整性。环境中LDH的活力越低，表明细胞膜受损的程度越小［3］。本试验结果与陈晓春等［2］的报道相一致。但与Jauregui等［4］报道小鼠肝脏细胞培养液上清中LDH活力为（9.2±1.5）×10－6IU不一致，这可能与试验动物不同有关。

4 结语

通过对蛋鸡肝细胞分离和制备方法进行优化，可使肝脏灌流成功率提高至100%，每只鸡可获（1.09±0.21）×109个肝脏细胞，肝细胞活率为（95.3±1.3）%；肝细胞形态和培养基上清液中的LDH活力与原方法无显著差异。因此，本试验方法与原有方法相比，更适用于产蛋家禽肝细胞的制备和培养，效果更佳。

［1］陈黎龙，江青艳，朱晓彤，等.成年鸡肝细胞的分离与原代培养［J］.江西农业大学学报，2008，30（3）：385－389.

［2］陈晓春，陈代文，张克英，等.AICAR和二甲双胍对产蛋鸡肝细胞AMPK活性及脂质代谢的影响［J］.畜牧兽医学报，2006，37（8）：769－773.

［3］Andradejr D R，Andrade D R，Santos S A.Study of Rat Hepatocytes in Primary Culture Submitted to Hypoxia and Reoxygenation：Action of the Cytoprotectors Prostaglandin E1，Superoxide Dismutase，Allopurinol and Verapamil［J］.Arquivos de Gastroenterologia，2009，46（4）：333－340.

［4］Jaurequi H O，Hayner N T，Driscoll J L，etal.Trypan Blue Dye Uptake and Lactate Dehydrogenase in Adult Rat Hepatocytes－Freshly Isolated Cells，Cell Suspensions，and Primary Monolayer Cultures［J］.In Vitro，1981，17（12）：1100－1110.