肾癌中miR-210的异常表达及意义

2012-11-23 09:13冷慧敏翟庆娜李贤新余振东桂耀庭
中国实验诊断学 2012年3期
关键词:肾癌定量测序

周 亮,冷慧敏,2,翟庆娜,2,王 勇,孙 亮,李贤新,余振东,桂耀庭

(1.北京大学深圳医院 男性生殖与遗传重点实验室,广东 深圳518036;2.汕头大学医学院)

肾癌发生发展的分子生物学机制尚未完全清楚,探索肾癌的致病基因对于了解肾癌的发病机制有重要的意义。microRNAs(miRNAs)是普遍存在的、调节基因表达的短非编码(约22nt)小分子调节RNAs,是由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。1993年,miRNAs在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegants)中首次被发现[1],人类基因组中编码超过1000个miRNAs。其功能是调节特异性mRNA靶标活性,每一个miRNA可以抑制数百个mRNAs,在生理和病理过程中大范围内发挥重要作用[2]。目前的研究证实约一半的miRNAs其上游基因位于染色体中与肿瘤相关的区域内,肿瘤的发生发展与miRNAs之间存在着错综复杂的联系[3]。

本实验室前期应用第二代大规模平行测序技术对10例肾透明细胞癌及其癌旁组织的microRNAs进行全基因组测序后发现:miR-210表达差异显著,与其癌旁组织相比较平均上调约26倍。本研究应用荧光定量PCR技术比较miR-210在52例不同阶段的肾细胞癌及其癌旁组织中表达量的差异[4],用统计学方法分析miR-210表达量的差异与肾癌病理分期、年龄及性别的关系,以求发现新的诊断指标和新的治疗肾癌的方法。

1 对象与方法

1.1 对象 收集北京大学深圳医院、深圳市人民医院、中山大学附属肿瘤医院泌尿外科等未经治疗的原发性肾细胞癌患者手术切除的癌及其相应癌旁组织标本52例。所有标本均有完整的临床病理资料,HE染色判定组织学类型,所有癌组织的相应癌旁组织为正常肾实质结构,无肿瘤细胞。所有病例均按照WHO分类标准进行诊断,病理分型和分期按照美国癌症联合会(AJCC)的TNM 分期进行[5]。肾癌临床病理资料见表1。

每例标本留取3份组织:一份经4%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋;一份立即置于4℃RNA Later(Ambion)中,24h后置于-80℃保存待用;一份放于液氮。

表1 52例肾癌患者临床病理资料

1.2 方法

1.2.1 前期测序及生物信息学分析 本研究组前期通过第二代大规模平行测序技术检测肾癌组织与远端癌旁组织差异表达的miRNAs和mRNA,发现表达上调和下调的miRNAs,其中miR-210在癌组织中显著上调。

1.2.2 总RNA提取与逆转录 用Trizol法分别提取52例肾癌及其相应癌旁组织的总RNA。无RNA酶的DNA酶I处理,紫外分光光度计和1.5%的琼脂糖凝胶检测示质量好,无降解。按照逆转录试剂盒(Fermentas公司)说明书,取1μg总RNA,用BIO-RAD(UV-2450)的PCR仪上进行。

1.2.3 荧光实时定量PCR(Realtime PCR)检测肾癌及相应癌旁组织中miR-210的表达量 采用miRNAs定 量 RT-PCR 检 测 试 剂 盒 (miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒,Qiagen,Germany生产分别检测52对肾癌及其癌旁组织中miR-210的表达量。上游引物由Invitrogen公司合成:5-CT-GTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3;下游引物是由miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒提供的通用引物(详见试剂盒说明书),反应在PRISM 7000实时定量PCR仪(Ambion)上完成。先将1μg总RNA反转录为第1链cDNA,以第1链cDNA为模板进行PCR扩增,扩增体系为:PCR Mix 10μl,引物0.8μl(0.2μmol/L),cDNA 1μl,ROX 0.4μl,ddH2O7.8μl;50℃ 2min,95℃ 2min,95℃ 15s,55℃20s,72℃30s,40个循环。U6snRNA作为内参照进行归一化。miR-210在肾癌组织中的表达量的计算公式为:2-△CT,其中△CT=CTmi-210-CTU6[6]。

1.3 统计学分析

应用SPSS10.0对数据进行统计学分析。对2-△CT的计算结果取对数[log2(x)],得到的结果用-△CT表示。应用配对t检验对-△CT的结果进行数据分析,数据以均数±标准差(±sx)表示,以比较肾癌和相应癌旁组织中miR-210表达水平的差异。应用卡方检验分析其差异与肾癌病理分期、年龄、性别的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-210在肾细胞癌及相应癌旁组织中的表达差异

2.1.1 总结分析前期数据 总结分析实验室前期通过miRNA测序技术对10例肾透明细胞癌及其癌旁组织miRNAs测序的结果,发现miR-210在癌组织中的表达较癌旁组织表达上调约26倍。

2.1.2 RNA抽提和质控 组织总RNA用TRIZOL法抽提,提取后于1.5%琼脂糖凝胶上样电泳,紫外照胶仪下观察,结果显示5s,18s,28s条带清晰,28s的亮度较18s高。同时紫外分光光度计检测示 A260/A280值介于1.80-2.10之间,A260/A230值均大于2.00。

2.1.3 荧光实时定量PCR检测miR-210在癌及相应癌旁组织中的表达差异 应用实时定量RT-PCR检测52对不同阶段新鲜肾癌及相应癌旁组织中miR-210的表达量,见图1。miR-210表达量的计算公式为:2-△CT,其 中 △CT= CTmi-210-CTU6[6]。 对2-△CT的计算结果取对数 [log2(x)],得到的结果-△CT符合正态分布。经SPSS10.0分析得出miR-210在肾癌组织的平均表达量为-5.788 4±5.085 0,癌旁组织的平均表达量为-7.476 1±4.591 4。miR-210在肾细胞癌与癌旁组织中的表达差异显著(P=0.00),见图2。

图1 肾癌及相应癌旁组织mir-210表达的荧光定量PCR结果电泳图

图2 miR-210在52例肾癌组织及相应癌旁组织中-△CT值的分布情况

2.1.4 荧光实时定量PCR产物测序结果 取miR-210在肾癌及其相应癌旁组织荧光定量PCR的产物进行Sanger测序,测序结果与之前第二代大规模平行测序技术所得的序列一致,表明PCR扩增产物正确。

2.2 miR-210表达量与肾癌病理分型、分期、年龄及性别的相关性

miR-210以肾癌组织miR-210表达量的平均值-5.7884为界,将52例病例分为miR-210低表达组和miR-210高表达组[7]。再分别按照年龄(中位年龄48岁)分为≤48岁组和>48岁组;按照性别分为男性和女性组以及按照 TNM 分期分为 T1-2N0M0组和T3-4N0M0 & TXNXMX组。研究结果显示:癌组织miR-210表达的高低与患者的年龄没有相关性(0.30<P);癌组织 miR-210表达的高低与患者的性别没有相关性(0.70<P);癌组织miR-210表达的高低与癌组织的TNM分期没有相关性(0.50<P),结果见表2。

3 讨论

肾癌是一种高致死性泌尿生殖道肿瘤,是泌尿系统第二大肿瘤,且发病率每年增长2.5%。虽然,近年来肾细胞癌在影像学、外科治疗和基础医学研究领域取得一定进展,但对于早期转移的肾细胞癌患者而言,常规治疗的应答率低(不超过25%)并伴有严重副作用。

表2 miR-210表达量与肾癌病理分期的关系

目前,miRNAs的表达和功能是肿瘤研究的热点问题。有研究认为,遗传或表观遗传的改变和与miRNA加工相关的基因及其蛋白的异常变化是miRNA表达异常的原因。主要的遗传改变是染色体异常,超过50%的miRNA位于脆性位点,并且常常与癌症相关[8]。Kort等研究认为肾母细胞瘤组织中miR-17-92簇过表达与转录因子E2F3活性增加有关。肾癌中低表达的let-7f是let-7家族成员,let-7在肿瘤中低表达是由于与其前体绑定的Lin-28和Lin-28BRNA结合蛋白抑制了let-7前体加工过程,导致其不能被加工为成熟的let-7,且负性调控RAS基因[9]。肾癌中高表达的miR-378通过抑制融合同源物抑制因子(sufs)与融合因子1(Fus-1)两种肿瘤抑制基因的表达促进肿瘤的生长和血管的发生[10]。高表达的miR-421使N-Myc转录因子过表达促进肿瘤形成[11]。

VHL参与的低氧通路与肾细胞癌发生密切相关,有研究表明miR-210在缺氧细胞中表达显著上调,对细胞生存至关重要[12]。2009年黄等人的研究发现miR-210表达依赖于HIF(缺氧诱导因子)-1α,此外,缺氧条件可以诱导miR-210在胰腺癌,乳腺癌,头颈部肿瘤,肺癌,结肠癌和肾细胞癌细胞株中的表达,表明miR-210在启动肿瘤发生过程中的重要作用[13]。最近的一项研究发现缺氧条件可以诱导肾细胞癌细株系7860表达miR-210,表明HIF-2α也可以调节的miR-210的表达[14]。以上研究意味着,HIF-1α可能是miR-210的最重要最直接的上游调控因子,可是当 HIF-1α缺乏时,HIF-2α也可以介导的miR-210的表达。通过靶基因3'UTR荧光素酶检测实验验证证实miR-210的靶基因为HOXA1,HOXA9和FGFRL1[15]。

本研究组前期利用miRNAs测序技术对10例肾癌及其癌旁组织提取的miRNAs进行测序并检测其表达差异,发现miR-210在肾癌中的表达上调最为显著。应用实时定量PCR对52例不同阶段的肾细胞癌及其癌旁组织进行检测,发现miR-210在癌组织中较相应癌旁组织中表达平均上调了7倍,由此证明miR-210对肾癌的发生和发展有着重要的作用。但进一步对表达量和临床信息的分析显示:miR-210的表达量与肾癌的病理分期、病人的年龄和性别并无显著相关,这样的结果可能与病例数目较少有关。本研究表明miR-210在肾癌发生过程中可能起到癌基因的作用,为肾癌的后续研究打下了良好的基础。

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