大鼠肾移植蛋白质组学双向电泳技术体系的建立

吕天羽，王 康，刘建军，何建凡，李德萍，唐 敏，王玉新，戴 勇＊

（1.厦门市第二医院，福建 厦门361021；2.深圳市人民医院，暨南大学第二临床医学院，广东 深圳518020；3.深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳518020；4.重庆医科大学，重庆400016）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物模型 雄性近交系lewis（RT11）大鼠6只，F344（RT11v1）大鼠6只，（均购自北京维通利华实验动物有限公司）体重260－280g。随机分组，F344大鼠为供体lewis大鼠为受体，获得同种异基因移植模型［1］。术后不给予免疫抑制剂干预治疗。术后3d动物仍存活则认为大鼠肾移植急性排斥反应动物模型建模成功。

1.1.2 标本收集 术后3d、7d取出移植肾，每个时间点样本为3只。标本一部分行HE染色病理学检查；另一部分液氮保存，待用。

1.1.3 试剂 固相pH梯度干胶条（pH4－7，13cm；pH3－11，13cm）、十二烷基硫酸钠（SDS）、TEMED、2Dclean－up kit、2DQuant Kit 购 于 Amersham Pharmacia Biotech公司；甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、过硫酸胺、硝酸银、碳酸钠、甘油、甘氨酸购于BBI公司；丙酮购于Sigma公司；蛋白酶抑制剂（Complete Mini，EDTA－free）购于 Roche公司，其他试剂为国产分析纯试剂。

1.1.4 主要仪器 IPGphor等电聚焦仪、SHE600垂直电泳仪、高精度扫描仪、ImageMaster 2D5.0凝胶分析软件为安玛西亚公司（Amersham Pharmacia Biosciences）公司产品。

1.2 方法

1.2.1 溶液成分 样品裂解液、IPG溶胀液、平衡液、银染溶液均参照郭尧君［2］著《蛋白质电泳实验技术》配制。

1.2.2 肾脏双向凝胶电泳 ①肾脏组织蛋白的制备取液氮中大鼠移植肾，室温解冻，研磨成细粉末状。按组织净重：裂解液＝1∶10比例其中加入蛋白酶抑制剂混合制剂 Complete Mini，EDTA－free，1片／10ml。冰上继续研磨。收集液体，4℃12 000×g 60分钟后收集上清液。再经以下处理（1）组织蛋白样品纯化（2）样品蛋白浓度测定。所得样品－80℃冰箱保存，备用。②双向凝胶电泳 按IPGphor TM等电聚焦系统指南进行双向电泳。③染色 银染色和考马斯亮蓝染色都是采用郭尧君［3］的染色方法并作适当改动。

1.2.3 2DE图像采集与分析

染色的凝胶经透射扫描用ImageMaster2D5.0软件分析，不同胶匹配点相对含量的比值＞2或者＜0.5认为存在差异。

2 结果

2.1 病理学结果

大鼠肾移植后7d可以看到肾小动脉周淋巴细胞浸润，结缔组织增生，肾小动脉外膜结缔组织增生，淋巴细胞浸润。

2.2 双向电泳凝胶结果

从四种不同角度对肾脏组织进行蛋白质图谱分析，分析结果如表1。

表1 双向凝胶电泳检测结果

3 讨论

肾移植急性排斥反应是排斥反应中最常见的一种类型。但是到目前为止，对于早期诊断肾移植急性排斥反应的发生仍没有可靠的依据。应用新的研究技术进一步探索其早期诊断的特征性标记物，成为了各国研究人员关注的焦点。双向电泳技术作为蛋白质组学研究的经典方法，它当然成为了现今研究的热点。因此建立一个专门针对肾脏组织成分变化的方案才能更好地应用蛋白质组技术开展肾移植排斥反应的研究。本研究以大鼠肾脏组织蛋白为样品，对样品制备、等电聚焦（IEF）上样量、凝胶染色等进行比较和条件的优化，获得满意的大鼠肾脏组织蛋白2DE图谱。

（1）本研究首先用13cm（pH3－11NL）的胶条进行IEF，发现组织蛋白广泛分布于等电点（PI）3－11的范围。大鼠肾移植同种异基因移植物检测到（626±49）个蛋白点，平均匹配率为65.76%；经ImageMaster2D5.0凝胶软件分析发现差异蛋白主要分布在PI4 5－7.0范围处，为更清晰观察和比较异基因移植物中差异性表达的蛋白分布情况，以下研究均采用13cm（pH4－7L）IPG胶条。

（2）组织样品中的非蛋白杂质如盐、外源带电小分子、去污剂等多种小分子，这些物质会影响IEF，使电压难以达到IEF所需，最终可能影响2DE的分离效果。本研究选用丙酮沉淀和2Dclean－upkit纯化样品，与处理前相比这两种方法均能得到清晰的蛋白点。但丙酮处理会致血清PI5－6处蛋白丢失，影响该区域差异蛋白的比较，为确保差异表达的蛋白均能呈现出来本研究采用2Dclean－upkit来处理样品。

（3）样品蛋白含量测定的准确性会直接影响IEF上样量的确定和2DE图谱蛋白点呈现的多少。如果异基因移植物样品的蛋白上样量太低，在2DE图谱染色呈现的蛋白点也很少，从而影响异基因移植物中蛋白质表达的比较。蛋白上样量过大的话对蛋白点的分离效果就不好，较模糊。本研究采用的蛋白不同上样量中，120μg蛋白能得到最佳的图谱效果，有差异表达的蛋白点显示较为清晰。但是这一上样量不一定就是最合适的，在今后的实验中仍需摸索。

（4）蛋白质被分离后，能否被有效检测，染色方法起到很重要的作用。2DE的染色方法有许多种。考马斯亮蓝染色［4］虽特异性高，但是对上样的剂量要求大，在相同上样量的情况下，与经改良的银染方案［5］相比较，其敏感性较差。最终以银染色法的电泳图谱更为满意。

通过对以上几种有可能影响组织蛋白质双向电泳的各因素比较，本研究获得了优化后的大鼠异基因移植物蛋白质图谱衍变的研究方案，即：使用13 cmIPG胶条（pH4－7L）进行等电聚焦、2Dclean－upkit纯化蛋白样品、改良的银染色法方案，为条件优化后的大鼠异基因移植物蛋白质2DE银染图谱。在相同条件下，分别对不同时间点的样品进行3次双向电泳实验，扫描图谱经ImageMaster2D5.0凝胶软件分析和数据统计后显示：移植后3d异基因移植物中检测到（512±62）个蛋白点，平均匹配率为76 32%；移植后7d异基因移植物中检测到（478±56）个蛋白点，平均匹配率为73.11%，提示本项研究采用的蛋白质双向电泳技术方案有较好重复性，为今后异基因移植物研究提供了一个新的实验体系。

［1］王 康，戴 勇，李德萍，等.大鼠原位肾移植模型肾静脉吻合方法的改良［J］.中华器官移植杂志，2006，27（1）：54.

［2］郭尧君.双向电泳.见：郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.第2版.北京：科学出版社，2005，203－207.

［3］郭尧君.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.见：郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.第2版.北京：科学出版社，2005：106－108.

［4］Candiano G，Bruschi M，Musante L，et al.Blue silver：A very sensitive colloidal Coomassie G－250staining for proteome analysis［J］.Electrophoresis 2004，25（9）：1327.

［5］王剑青，戴 勇，邓国安，等.尿毒症患者血清蛋白质组份的双向凝胶电泳－飞行时间串联质谱分析研究［J］.中华肾脏病，2005，9（21），506.