脂联素对高糖环境下人心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响1）

李雅蓉，李 兴

近年多项研究表明，在众多脂肪细胞分泌的蛋白和代谢物中，脂联素（ADPN）是唯一提高胰岛素敏感性、对心血管具有保护作用因子。本研究旨在探讨脂联素对高糖环境下心肌细胞凋亡的影响，以揭示脂联素对糖尿病心肌病（DCM）中心肌细胞的可能保护机制，为防治糖尿病心肌病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人心肌细胞株（HCM）购于美国SinceCell公司上海代购，DMEM培养基（美国HyClone公司），胰蛋白酶（北京Solarbio公司），胎牛血清（美国HyClone公司），D-葡萄糖（北京Solarbio公司），MTT试剂盒（美国Sigma公司），脂联素（Human gAcrp美国Pepro Tech公司），Trizol试剂（上海生工生物工程有限公司），FastStart Universal SYRB Green Master（ROX，美 国 Roche 公 司 ）。Bax 引 物，上 游：5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′；下 游：5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′。Bcl-2引物，上游：5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′；下游：5′-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3′。β-actin引物，上游：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下 游：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′184bp（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 人心肌细胞的培养及分组 HCM培养于含10%胎牛血清，5.5mmol／L D-葡萄糖，100U／mL青霉素，100μg／mL链霉素的DMEM培养基中，并置于37℃含5%的CO2的孵箱中孵育，细胞生长至约85%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。正常对照组D-葡萄糖浓度5.5mmol／L；高糖组D-葡萄糖浓度30.0mmol／L；高糖加脂联素组D-葡萄糖浓度30.0mmol／L+ADPN 2.5μg／mL。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT法 取部分生长状态佳的细胞，以1×104个／mL接种至96孔板，待细胞贴壁后，改用无血清培养基培养6h。按照实验分组进行干预，每组设3个复孔，同时设凋零孔，分别培养24h、48h、72h后，每孔加入 MTT 20μL，孵育4h后，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，待DMSO溶解后，于酶标仪490nm处测得吸光度OD值。

1.3.2 流式细胞术 取部分生长状态佳的细胞，以1×105个／mL接种至6孔板，待细胞贴壁后，改用无血清培养基培养6h，使细胞同步化，弃去培养液，按照实验分组进行干预，每组设3个复孔，分别培养24h、48h、72h，用脂结合蛋白AnnexinV／碘化丙啶（PI）双染色标记后，流式细胞仪测细胞的凋亡百分率。结果判断，正常活细胞AnnexinV／PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染，PI低染；坏死细胞AnnexinV／PI均高染。

1.3.3 荧光定量PCR 总RNA的提取，细胞生长至约80%融合时，弃去培养基，加入无血清培养基6h后，按实验分组进行干预，弃去上清，加入Trizol试剂提取总RNA。将RNA反转录为 cDNA。 目 的 基 因 Bax 引 物，上 游：5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′；下 游：5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′。Bcl-2引物，上游：5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′；下游：5′-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT。β-actin引物，上游：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下 游：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′184bp。PCR反应体系：FastStart U-niversal SYRB Green Master（ROX），上游引物（15μmol），下游引物（15μmol），cDNA，无DNAse和RNAse水。PCR反应条件：95℃变性10min，95℃15s，58℃45s，共45个循环。由PCR反应曲线得到Ct值，采用2-△△Ct方法计算相对定量结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析进行组间比较。

2 结 果

2.1 MTT结果 与对照组相比，高糖组细胞在24h时，细胞增殖增加，48h、72h细胞增殖受到抑制（P＜0.05）。脂联素组与高糖组相比，24h时细胞增殖情况无统计学意义，48h、72h细胞增殖明显增加（P＜0.05）。详见表1。

表1 脂联素对高糖环境下心肌细胞增殖的影响（OD值）（x±s）

2.2 流式细胞术 与对照组相比，高糖组的细胞在各个时间段凋亡率均增加（P＜0.05）。脂联素组与高糖组相比，48h、72h细胞凋亡率均减少（P＜0.05）。各时间段脂联素组之间差异有统计学意义，随着时间推移，细胞凋亡率降低。详见表2。

表2 脂联素对高糖环境下心肌细胞凋亡率的影响（x±s） %

2.3 荧光定量PCR结果 与对照组相比，高糖组的细胞在各个时间段Bax的表达增加（P＜0.05），Bcl-2的表达降低（P＜0.05）。脂联素组与高糖组相比，48h、72hBax表达下调（P＜0.05），而Bcl-2的表达上调（P＜0.05）。各时间段脂联素组之间差异有统计学意义（P＜0.05），即随着时间推移，Bax表达下调，而Bcl-2上调。详见表3。

表3 脂联素对高糖环境下心肌细胞Bcl-2／Bax（2-△△Ct）表达的影响（x±s）

3 讨 论

DCM是糖尿病引起的最常见和最严重的心血管并发症，是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。它是独立于高血压心脏病、冠心病、瓣膜病变引起的心脏病等以外的一种特异性心脏病，其主要的病理改变表现为心肌细胞肥大、心肌纤维化、细胞外基质沉积、心肌细胞凋亡增加等。临床上早期主要表现为心脏舒张功能不全，晚期以收缩功能不全为主，最终发展成为充血性心力衰竭。糖尿病心肌病的发病机制，目前尚未完全阐明，主要认为与心肌能量代谢紊乱［1，2］、血管及自主神经紊乱、胰岛素抵抗［3］以及其他细胞因子的参与等有关。

高血糖是糖尿病心肌病的主要病因，而由高血糖引起的心肌细胞凋亡是导致糖尿病心肌病发病和病程进展的关键因素。本次研究MTT结果，高糖组24h细胞增殖增加，可能与细胞的应激有关。通过抗氧化作用和凋亡信号转导途径抑制细胞凋亡，可以阻止糖尿病引起的心脏毒性作用，表明在糖尿病心肌病的发展过程中，心肌细胞凋亡是一个重要因素。心肌细胞凋亡过程与多种途径有关，包括凋亡／抗凋亡基因失调、线粒体凋亡通路、膜受体凋亡通路以及氧化、硝化应激等导致的细胞凋亡［4，5］。

Bcl-2家族是与细胞凋亡紧密相关的基因家族，该家族的蛋白产物从功能上分为两类：一类具有抑制凋亡作用，如：Bcl-2、Bclxl、Mcl-1等；另一类则具有促进凋亡作用，如Bax、Bak、Bok等。生理情况下，抑制凋亡和促进凋亡的蛋白维持动态平衡，当机体或细胞受到有害刺激时，平衡被打破，出现细胞凋亡增加或发生肿瘤。Bcl-2家族成员之间虽然有功能上的重叠［6］，但是这些蛋白都是正常组织发育和维持自身稳态所必需的。Bcl-2和Bax是目前研究比较明确的一对拮抗基因。Bcl-2是从滤泡B细胞瘤中克隆出的第一个抑制凋亡的蛋白，主要位于线粒体膜、滑面内质网及核膜上，可抑制多种原因引起的细胞程序性死亡；Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成员，是一个可溶性蛋白分子，主要位于细胞质中，当凋亡信号发生时，Bax从胞质中转移到线粒体，并与线粒体膜相结合，发挥促凋亡作用。Bcl-2在细胞中是以同源二聚体（Bax／Bax）或异源二聚体（Bax／Bcl-2）形式存在的，Bcl-2过渡表达与Bax构成异源二聚体而阻抑细胞凋亡，而当Bax过度 表 达 时， 形 成 Bax-Bax 同源二聚体可促进细胞凋亡［7］。细胞受到凋亡刺激信号后，Bcl-2／Bax表达产物的比值可能决定细胞是趋于存活还是死亡。当Bcl-2／Bax＞1时，对细胞凋亡起抑制作用，细胞趋向于存活；当Bcl-2／Bax＜1时，对细胞凋亡起促进作用，细胞趋向于死亡［7，8］。本实验研究结果显示，高糖环境下培养细胞，随着时间推移，Bax表达增加，Bcl-2的表达则减少，加入脂联素后，Bax表达下调，Bcl-2表达增加，抑制了细胞的凋亡。

脂联素是近年来发现的由脂肪组织分泌的一种内源性生物活性多肽，具有抗炎、抗动脉粥样硬化、提高胰岛素敏感性及调节能量代谢等作用。流行病学调查显示［9］，在肥胖、糖尿病和高血糖症患者体内，脂联素水平降低，并且导致心血管病风险增加。前期研究表明，T-钙粘蛋白在1型糖尿病大鼠的心肌细胞膜及核周都有表达，其表达量与血清脂联素水平成正相关，且随着病变的进展表达逐渐增加［10］，而且脂联素可以时间依赖性的增加高糖环境下心肌细胞T-钙粘蛋白的表达，可能与氧化应激时T-钙粘蛋白上调性表达有关，通过与脂联素结合后激活磷脂酰肌醇-3-激酶信号途径从而对抗氧化应激导致的细胞凋亡，并且可以提高细胞在氧化应激状态下的生存能力［11］。本研究发现，脂联素可以通过影响凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达，通过影响二者的比例来抑制人心肌细胞凋亡，并且这种作用呈时间依赖性关系。

心肌细胞无分裂或再生能力，细胞凋亡的多少在很大程度上决定了心功能的损害程度，因此通过各种途径减少心肌细胞凋亡是保护心肌的一个重要途径，脂联素这种抑制心肌细胞凋亡从而保护心血管的作用，为糖尿病心肌病的治疗提供了新的思路，也为脂联素应用于临床提供了新的依据。

［1］ Herrero P，Peterson LR，McGill JB，et al.Increased myocardial fatty acid metabolism in patients with type 1diabetes mellitus［J］.Am Coll Cardiol，2006，47（3）：598-596.

［2］ van Herpen NA，Schrauwen-Hinderling VB.Lipid accumulation in non-adipose tissue and lipotoxicity［J］.Physiol Behav，2008，94（2）：231-241.

［3］ Lebeche D，Davidoff AJ，Hajjar RJ.Interplay between impaired calcium regulation and insulin signaling abnormalities in diabetic cardiomyopathy［J］.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2008 ，5（11）：715-724.

［4］ Chen S，Evans T，Mukheriee K，et al.Diabetes-induced myocardial structural changes：Role of endothelin-1and its receptors［J］.Mol Cell Cardiol，2000，32（9）：1621-1629.

［5］ Zhou YT，Grayburn P，Karim A，et al.Lipotoxic heart disease in obese rats：Implicati on for human obesity［J］.Proc Nati Acad Sci USA，2000，97（4）：1784-1789.

［6］ Rathmell JC，Lindsten T，Zong WX，et al.Deficiency in Bak and Bax perturbs thymic selection and lymphoid homeostasis［J］.Nat Immunol，2002，3（10）：932-939.

［7］ Schabitz WR，Sommer C，Zoder W，et al.Intravenous brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size and counterregulates Bax and Bcl-2expression after tempor ary focal cerebral ischemia［J］.Stroke，2000，31（9）：2212-2217.

［8］ Isenmann S，Stoll G，Schroeter M，et al.Differential regulation of Bax，Bcl-2，and Bcl-X proteins in focal cortical ischemia in the rat［J］.Brain Pathol，1998，8（1）：49-62.

［9］ Zhu W，Cheng KK，Vanhoutte PM，et al.Vascular effects of adiponectin：Molecular mechanisms and potential therapeutic intervention［J］.Clin Sci（Lond），2008，114（5）：361-374.

［10］ 田腊梅，李兴.脂联素及T-钙黏蛋白与大鼠糖尿病心肌病的关系［J］.中国糖尿病杂志，2008，16（8）：505-506.

［11］ 李淑帆，李兴.脂联素对高糖环境下人心肌细胞增殖及caspase-3、T-钙黏蛋白表达的影响［J］.医学研究杂志，2010，39（6）：58-60.