急性白血病病人黏着斑激酶的表达及临床意义

阚玉玲，管洪在

（青岛大学医学院血液学教研室，山东 青岛 266021）

黏着斑激酶（FAK）属于细胞浆内非受体蛋白酪氨酸激酶（NRPTKs），位于细胞和细胞外基质结合部位整合素构成的灶性黏附复合体上。研究发现，FAK不仅在正常细胞的生长周期、增殖分化、迁移运动及血管生成等过程中发挥重要作用，而且在多种肿瘤细胞中高表达，在肿瘤细胞激活及侵袭转移过程中起关键作用，已逐渐成为目前肿瘤治疗的新靶点［1－2］。越来越多的证据显示，FAK基因的过表达及FAK的激活与许多人类实体肿瘤及血液恶性肿瘤的发生、发展、侵袭转移密切相关［3］。本研究通过检测急性白血病（AL）病人白血病细胞FAK基因表达，旨在探讨其与AL发生、发展及预后的关系。现将结果报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2010年8—12月在青岛大学医学院附属医院就诊的AL病人50例，男22例，女28例；年龄10～82岁，中位年龄48岁。其中急性非淋巴细胞白血病（ANLL）36例（M1型1例，M2型16例，M3型10例，M4型5例，M5型4例），急性淋巴细胞白血病（ALL）14例（L1型6例，L2型8例）。初诊病人30例，复发7例，缓解13例，其中复发和缓解病人均非该初诊病人转化而来。诱导缓解化疗方案：初治ALL选用VDCP或VDLP方案；初治急性髓样白血病（AML）选用DA或MA方案；M3病人采用全反式维甲酸（ATRA）或三氧化二砷（As2O3）治疗，如白细胞增高加小剂量HA或标准剂量DA。以上病人的诊断及疗效标准均参照张之南等［4］主编的《血液病诊断及疗效标准》。选择10例健康人作为正常对照组，男5例，女5例；年龄18～57岁，中位年龄43岁。

1.2 基因提取及扩增方法

1.2.1 单个核细胞（MNC）的分离 在无菌条件下采集骨髓液2 mL，EDTA抗凝，用Ficoii淋巴细胞分离液（相对密度1.077）分离MNC，用1×PBS洗涤2～3次。－80℃冻存备用或直接提取RNA。

1.2.2 总RNA的提取 用原平皓（天津）生物技术有限公司提供的RNApure超纯总RNA离心柱式试剂盒提取RNA。经紫外线分光光度计测定RNA纯度（A260／A280＞1.6），同时进行 RNA 定量测定。在15 g／L琼脂糖凝胶上电泳可见3条清晰亮带，说明所提取RNA完整。

1.2.3 c DNA合成 应用M－MVL逆转录试剂盒（Fer mentas公司）合成c DNA。逆转录反应体系20 mL，包括总 RNA 1μg，0.5 g／L的 OLigo（d T）pri mer 1μL，使用DEPC水补充至12μL。快速瞬时离心，置65℃孵育5 min，立即置于冰上；然后依次加入55×缓冲液4μL，RNase抑制剂1μL，10 mmo L／L d NTP Mix 2μL，混匀，42℃2 min；再加入逆转录酶（M－MLV）1μL，42℃反应30 min，70℃下放置10 min，冰上5 min。

1.2.4 PCR反应 PCR反应体系包括逆转录产物4μL，20μmol／L的FAK正、反义链引物各1μL，2×PCR Mix10μL（其中包括10mmol／L 的d NTPs、10×缓冲液、Taq DNA 聚合酶），其余以DEPC水补足至20μL。所用引物根据Gen Bank提供的FAK mRNA序列，由上海生工公司设计合成。FAK正义链为5′－TATTGGACCTGCGAGGGATTGG－3′，反义链为5′－GAGGCGGTTTCTTTGGTGGAGC－3′，目的基因长度为255 bp。β－actin正义链为 5′－AAACACCCCAGCCATGTACGT－3′反义链为5′－GTGGTGGTGAAGCTGTAGC－3′，目的基因长度为228 bp。内参照与目的基因分别扩增，PCR条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，60℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃ 再延伸5 min。

1.2.5 PCR产物分析 取PCR产物10μL与Loading Buffer 2μL混合，在15 g／L琼脂糖凝胶中电泳，80 V恒压电泳25 min，EB染色［5］。阳性结果可见228、255 bp处各有一条亮带，分别为β－actin和FAK。紫外线透射仪观察并照相，照片经Metamor ph I maging Sight软件进行分析并读取吸光度值，取FAK与β－actin曲线下面积的比值作为FAK mRNA的相对含量。

1.3 染色体的制备及R显带和核型分析

1.3.1 染色体的制备 将白血病病人骨髓细胞按（1～2）×109／L的密度接种于 RPMI 1640培养基中，培养24 h，加入0.05 mg／L秋水酰胺，37℃ 孵育1 h。1000 r／min离心10 min，弃上清液，加入预温至37℃的0.075 mol／L KCl溶液8 mL，37℃孵育30 min进行低渗。加入1 mL固定液（甲酸∶乙醇＝3∶1）轻轻混匀进行预固定，离心后再进行3次固定，将最后一次固定的标本以1 000 r／min离心10 min，弃上清液，加入适量固定液配成细胞悬液，备用［6］。

1.3.2 染色体R显带 采用气干法制片，将制备好的片子晾干，放入R显带液中，87.5℃水浴70～80 min。取出片子水洗，晾干，再加Giemsa液染色15 min，水洗，干后镜检。

1.3.3 染色体核型分析 每例病人分析10～20个分裂中期细胞，观察有无染色体异常。

1.4 统计学处理

应用SPSS 11.0软件进行统计学处理，两组率比较用χ2检验和精确概率检验；计量数据以±s表示，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 FAK mRNA在AL病人骨髓MNC中的表达

AL病人FAK mRNA阳性表达率为66.0%，与正常对照组（20.0%）比较差异有显著意义（χ2＝5.49，P＜0.05）。其中ALL和ANLL病人阳性表达率分别为71.4%和63.9%，二者差异无显著意义（P＞0.05），但两者均高于正常对照组（P＝0.04；χ2＝4.44，P＜0.05）。ALL和 ANLL病人 FAK mRNA的表达水平分别为0.75±0.12和0.65±0.17，二者差异无显著性（P＞0.05），但与正常对照组（0.31±0.15）比较，差异有显著意义（t＝7.98、5.60，P＜0.05）。部分病人电泳结果见图1。

图1 部分病人FAK mRNA电泳结果

2.2 FAK mRNA在不同时期AL病人的表达

初诊组和复发组AL病人白血病细胞FAK mRNA的阳性表达率分别为80.0%、85.7%，两组比较差异无显著性（P＞0.05），但均高于正常对照组（χ2＝9.38，P＜0.05；P＝0.02）。初诊组和复发组AL病人白血病细胞FAK mRNA表达水平分别为0.72±0.12、0.87±0.15，两组比较差异无显著意义（P＞0.05），但均高于正常对照组（t＝8.79、7.58，P＜0.05）。缓解组病人FAK mRNA的阳性表达率为23.1%，均明显低于初诊组和复发组，差异均有显著意义（χ2＝10.26，P＜0.05；P＝0.02）；与正常对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。缓解组病人FAK mRNA表达水平为0.27±0.17，明显低于初诊组和复发组（t＝4.44、7.82，P＜0.05），与正常对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。

2.3 FAK mRNA的表达与骨髓细胞染色体核型的关系

AL病人骨髓细胞染色体异常核型的检出率为64.0%（32／50）。FAK mRNA 在异常核型组的阳性表达率为78.1%，明显高于异常核型未检出组的44.4%（χ2＝5.82，P＜0.05）；FAK mRNA 在异常核型组的表达水平为0.75±1.17，明显高于异常核型未检出组的0.45±0.11（t＝6.72，P＜0.05）。

3 讨 论

FAK是SCHALLER等［7］于1992年发现的能使Src内源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物，在丝氨酸转化细胞的磷酸化蛋白中发现。FAK广泛分布于成纤维细胞、血小板、表皮细胞、内皮细胞、TC、BC、中性粒细胞、单核细胞和滋养层细胞等的细胞质中。已知FAK有6个可以被磷酸化的酪氨酸位点，FAK主要通过这些位点的磷酸化并与含有SH2或SH3结构域的蛋白质相结合，通过整合素、FAK／Src／Pl30CAS／JNK、FAK／PI3激酶以及FAKROCK／Rho A等多条信号通路参与细胞多种生物学过程，并参与肿瘤发生、发展、侵袭与转移［3］。

白血病是遗传学和表型上异质性疾病，为多种癌基因、抑癌基因结构或表达异常及细胞信号转导通路调节失衡等协同作用的结果。迄今，有关FAK与白血病相关性研究报道较少。2004年RECHER等［8］报道，在AML中发现有FAK蛋白的高表达和过度激活，并提示FAK的高表达与白血病细胞的迁移、预后及耐药性有关系。

本研究结果显示，AL病人FAK基因的表达率、表达水平均明显升高，其升高的具体机制不是十分清楚。先前有研究结果表明，FAK的磷酸化受到整合素、细胞因子、致癌基因和酪氨酸激酶受体的调节［9］。异常整合素或细胞因子的信号通路以及Ras等致癌基因产物的表达均可以导致AML细胞中FAK的磷酸化，从而进一步导致下游一系列信号通路的持续激活。另外有研究结果显示，在A ML细胞中20%的病人有8q22－8q24染色体区域扩增，而这个区域正是FAK基因所在，因此，8q的扩增可能与FAK在ANLL细胞异常表达有关系。FAK与血液系统中B细胞成熟过程也有关系，LE等［10］研究显示，FAK是CXCL12－CXCR4轴的下游信号分子，并介导细胞的黏附作用。CXCL12诱导未成熟B细胞FAK蛋白磷酸化，通过PKC等信号共同调控细胞的成熟与运动。有关FAK基因在ALL表达增高的具体机制仍需进一步探讨。

本研究结果还显示，初诊组和复发组病人白血病细胞FAK基因的表达率和表达水平较正常对照组明显升高，而缓解组则明显降低，推测FAK基因表达与白血病的病情进展有关，是预后不良的因素之一。TARDY等［11］最近研究显示，A ML病人白血病细胞中FAK蛋白高表达则其预后相对较差。本文结果与TARDY等［11］的研究结果一致，说明FAK是影响白血病病人生存率的重要因素之一。

LE等［12］采用 BCR－ABL－Ba F3细胞系 （一种BCR－ABL基因转染的前B淋巴细胞）研究显示，FAK基因沉默技术使细胞的增殖和克隆形成均减少，中位生存期延长，且伊马替尼对BCR－ABL细胞的疗效增加。这表明FAK对ALL的进展具有一定的促进作用。FAK的高表达抑制肿瘤细胞失去细胞黏附后的失巢凋亡，导致癌细胞以非锚定生长方式不断增殖，这有助于肿瘤细胞的存活和侵袭转移。FAK的高表达可能是造成白血病细胞耐药的又一重要因素。

不同种类的白血病常有各自的特征性染色体异常，因此染色体检查有助于白血病的诊断和预后判定。本研究显示，异常核型检出组FAK mRNA的阳性表达率及表达水平明显高于未检出组，表明该基因的表达与染色体的改变具有内在联系。磷酸化FAK表达上调在细胞基因突变中起着重要作用，它能够上调细胞增殖、扰乱细胞间的接触抑制、抗凋亡、促进细胞的侵袭以及血管生成等。染色体异常病人FAK mRNA表达增高可能是由于基因插入、缺失等原因激活了该基因的表达，但是具体机制还需进一步的研究。

许吕宏等［13］成功构建FAK sh RNA慢病毒载体，发现基因沉默技术可诱导白血病细胞凋亡。提示抑制该基因会在源头上阻止白血病的发生。另外，选择FAK抑制剂FIP200等或选择性抑制FAK的催化活性均可抑制FAK的功能，从而阻断多条与肿瘤相关的信号通路。这可能是更加接近针对白血病本质的治疗策略，FAK可能是白血病治疗的一个新靶点。

［1］GOLUBOVSKAY V M，K WEH F A，CANCE W G.Focal adhesion kinase and cancer［J］.Histol Histopat hol，2009，24（4）：503－510.

［2］MENG X N，JIN Y，YU Y，et al.Characterisation of fibronectin mediated FAK signalling pat h ways in lung cancer cell migration and invasion［J］.Br J Cancer，2009，101（2）：327－334.

［3］HECKER tP，GLADSON C L.Focal adhension kinase in cancer［J］.Fr ont Biosci，2003，8：S705－S714.

［4］张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］.3版.北京：科学出版社，2007：134－138.

［5］吕涛，管洪在.急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义［J］.青岛大学医学院学报，2010，46（3）：212－218.

［6］李萍，管洪在，杨颉，等.格列卫对慢性粒细胞白血病病人Ph染色体和bcr／abl融合基因表达影响［J］.齐鲁医学杂志，2009，24（4）：289－294.

［7］SCHALLER M D，BORGMAN C A，COBB B S.PP125FAK a structurally distinctive protein－tyrosine kinase associated with focal adhesions［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89（11）：5192－5196.

［8］RECHER C，YSEBAERT L，BEYNE－RAUZY O，et al.Expression of focal adhesion kinase in acute myeloid leukemia is associated with enhanced blast migration，increased cellularity，and poor prognosis［J］.Cancer Res，2004，64（9）：3191－3197.

［9］PARSONS J T.Focal adhesion kinase：the first ten years［J］.Cell Sci，2003，116：1409－1416.

［10］LE Y，GHU B M，HARLEY B.SOCS3 protein develop mentally regulates the chemokine receptor CXCR4－FAK signaling pathway during B ly mphopoiesis［J］.Immunity，2007，27（5）：811－823.

［11］TARDY E，CORNILLON J，CA MPOS L，et al.Prognostic val ue of CXCR4 and FAK expression in acute myelogenous leukemia［J］.Leuk Res，2009，33（6）：764－768.

［12］LE Y，XU L，L U J.FAK silencing inhibits leuke mogenesis in BCR／ABL－transf or med hematopoietic cells［J］.Am J Hemat ol，2009，84（5）：273－278.

［13］许吕宏，方建培，LE Y.FAK基因沉默诱导白血病细胞凋亡［J］.中国病理生理杂志，2010，26（7）：1352－1355.