核转录因子kappaB在急性心肌梗死后心室重塑中作用研究

陕西省宝鸡市中心医院（宝鸡721008） 樊冬梅 薛 莉

心肌梗死后普遍伴随着左心室重塑，指的是左室腔、几何结构和功能的改变。左心室重塑是一个慢性进展过程，心肌细胞和细胞外基质递进性改变，导致左室的扩大、收缩功能的下降和潜在的室性心律失常、心衰、和随后心血管性猝死［1］。心室重塑过程的具体机制不断得到阐明，其中炎症反应和其细胞因子的作用越来越受到重视。本研究应用细胞免疫化学染色观察急性心肌梗死（AMI）后心室重塑患者外周血单个核细（PBMCs）的核因子-kappaB（NF-κB）活性及其与血浆细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）分泌的相关性来探讨心室重塑的发病机制。

1 资料与方法

1 一般资料 急性心肌梗死患者来自我院2008年12月至2009年9月心内科住院病人，共58例，AMI的诊断标准根据1981年WHO制定心肌梗死诊断标准。心功能采取killip分级法，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。所有受试者均除外陈旧性心肌梗死、其他心脏病、各种炎症、恶性肿瘤、风湿活动、内分泌疾病等。以左心室舒张末期容积指数增加率（ΔLVEDVI）＞20%作为AMI后心室重塑的分组标准［2］：A组：左心室重塑组（ΔLVEDVI＞20%）33例，男20例，女13例，平均年龄为59.7±8.4；B组：非左心室重塑组（ΔLVEDVI≤20%）25例，男15例，女10例，平均年龄为58.6±5.9。另取门诊体检健康者为C组：20例，男性12例，女性8例，平均年龄57.8±6.5岁。

2 方 法

2.1 试剂及仪器 ：淋巴细胞分离液（中国医学科学院生物工程研究所）、1640培养基（Sigma Co）、小牛血清（FCS）（郑州佰安生物工程有限公司）、细胞离心机cytospin-2型（British.SHANDON）、NF-kB（p50）兔抗、链酶亲和素一生物素过氧化物酶试剂盒（SABC），试剂盒（单克隆鼠抗兔）及DAB试剂盒均购自武汉博士德公司。TNF-α、IL-1β放免试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放射免疫研究所。

2.2 标本采集：采血均得到患者同意，用肝素锂5ml真空采血管无菌采取确诊AMI患者发病的3d及14d空腹静脉血5ml。

2.3 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离：取抗凝3ml血液用磷酸缓冲液（PBS）1∶1稀释后，以2∶1体积置于淋巴细胞分离液上，3000r／min离心30min，收集试管中间悬浮的一层乳白色的液体，即为外周血单个核细胞（PBMCs）。再以磷酸缓冲液（PBS）洗涤3次，每次1000r／min离心5min。用台盼蓝拒染试验活细胞比例大于95%为有效标本。1640培养基调整细胞数为25×107个／ml，取100ul细胞混悬液滴入细胞离心机600r／min，离心6min，使细胞甩于载玻片上，室温下自然风干，丙酮固定5min，干燥后保存于-70℃冰箱待测NF-κB活性。

2.4 NF-κB的免疫组化染色（SABC法）：第一抗体选用兔抗NF-κBp50亚单位的多克隆抗体，抗体稀释度经预实验定为1×100，二抗为生物素化单克隆小鼠抗兔IgG，采用SABC法试剂盒检测。操作步骤按试剂盒说明书进行，每张涂片随机选取5个不重叠的高倍镜视野，随机计数500个细胞，计算细胞核阳性的细胞数占细胞总数的百分率。免疫细胞化学染色结果判定：PBS代替一抗为空白对照，细胞染色为棕黄色者为阳性，定位于胞质与胞核。PBMCs中NF-κB的活化水平用NF-κB（+）cells占所有定量化的PBMCs的百分比来表达。即阳性率＝阳性细胞数／总细胞数×100%

2.5 血浆细胞因子的测定：取出2ml血液置于离心管中，以2500r／min离心20min，取上层血浆置于-70℃冰箱保存，待测细胞因子（TNF-α，IL-1β）；利用液相竞争抑制原理，采用平衡法对样品进行测定。将待测样品或标准与限量的抗血清及标记的抗原加在一起进行竞争结合反应，加入免疫分离剂分离出抗原抗体复合物，测定复合物的放射性（B），计算各标准管的结合率（B／B0%.）做出标准曲线，由GC-1200r放射免疫计数器查出样品浓度。

2.6 超声心动图检查：所有患者入院后第3天和第30天进行超声心动图检查，测定左心室舒张末期内径（LVED）。按Simpson法计算左心室舒张末期容积（LVEDV），经体表面积校正后计算出左心室舒张末期容积指数（LVEDVI），并进一步计算出ΔLVEDVI ＝（30dLVEDVI-3dLVEDVI） ／3dLVEDVI×100%。

2.7 统计学处理：应用SPSS 11.5分析软件，计量资料均采用±s表示，计数资料用χ2检验，三组间细胞因子比用单因素方差分析；PBMC的NF-κB与细胞因子间的相关程度采用直线相关性分析法；进行统计处理，显著性检验水准取a＝0.05。

结 果

1 NF-κB检测结果 AMI后重塑组血浆TNF-α、IL-1β和外周血单个核细胞NF-κB核染色阳性百分率测量结果均显著高于未重塑组、健康对照组（见表1及附图）。AMI后重塑患者外周血单个核细胞NF-κB核染色阳性百分率为显著高于未重塑组、健康对照组3d三组分别：26.0%±7.60%，22.30%±5.46%、10.05%±5.23%；14d：20.45%±5.46%、13.00%±4.62% 、10.0%±5.23%。

2 通过相关性分析发现 急性心肌梗死患者外周血单个核细胞NF-κB核染色阳性百分率与TNF-α、IL-1β表达均呈正相关（rTNF-α＝0.649，P＜0.01；rIL-1β＝0.535，P＜0.01）（见表2）。

3 通过χ2检验发现 对照组和观察组的性别和心功能分级（killip分级），及合并症无显著性差异。

表1 外周血单个核细胞NF-kB染色阳性率与血浆细胞因子测定（%，ng／ml，±s）

表1 外周血单个核细胞NF-kB染色阳性率与血浆细胞因子测定（%，ng／ml，±s）

注：在发病3d，A组与B组方差分析值P＞0.05.；14d的A和B图方差分析值P＞0.05.

心室重塑组（A组） 心室未重塑组（B组）项 目对照组（C组3d 2周3d 2周NF-KB TNF-a Il-1β）0.11±0.05 26.00±7.60 1.73±0.28 0.56±0.22 20.45±5.46 1.65±0.20 0.44±0.20 22.30+8.22 1.59±0.28 0.48±0.11 13.00±4.62 1.39±0.25 0.14±0.04 10.05±5.23 1.27+0.23

表2 NF-KB 相关性分析

图1、2：AMI后未重塑患者；图3：AMI后重塑患者；图：外周血PBMCs中NF-kB免疫细胞化学染色结果（10×100倍）

讨 论

急性心肌梗死心肌坏死可继发的局部和全身的系统性炎症反应导致组织损伤和心肌扩大及心力衰竭，即不可逆的心室重塑［3］。

NF-κB扮演一个炎症反应和先天免疫的中枢调节因子，NF-κB的活性是通过控制细胞的增殖迁移、细胞的分化和细胞的凋亡发挥作用的。它属于Rel家族（p50，p52，p65，c-Rel，and RelB），享有保守的Rel同源序列，能形成异源二聚体（p50／p65，p50／p50，或p65／p65），存在于细胞质中。在静息状态下，细胞质中NF-κB是静止的、无活性的，被IκB抑制。各种刺激包括致炎因子，氧化应激，细菌和病毒产物，或缺氧刺激激活。在NF-κB经典的激活通路中，IKK复合物磷酸化IκB，导致26S蛋白体泛蛋白化和降解，因此暴露NF-κB亚单位上的核定位信号和NF-κB的转录上调各种靶基因，参与各种生理和病理过程，包括AMI。AMI发生后，激活的NF-κB介导了左心室重塑和心功能恶化［4］。事实上，对于NF-κB功能更详细功能是不同的亚单位有不同的功能，在这项研究，我们的焦点集中在心梗后NF-κB p50，p50亚单位是通常考虑是NF-κB复合物的抑制剂［5］，因为p50／p50同源二聚体是一直转录活性的必需的。

许多研究显示NF-κB是心肌缺血的炎症反应介质，TOLL受体，它的信号传导通过NF-κB，而TOLL受体在心肌梗死后左室重塑起中枢性的作用［6，7］，通过用IKB酶的磷酸化抑制剂抑制NF-κB的核易位，左室重塑和心力衰竭可以被改善［8］，注射有高亲和力双股诱导DAN的阻断NF-κB，可以减轻大鼠模型的心肌缺血和再灌注损伤［9］，Frantz等［10］用 ELISA 等方法对心肌梗死后10周鼠的心肌细胞NF-κB易位情况的研究表明：在心肌梗死后心肌细胞中NF-KB慢性并持续的激活。动物实验表明NF-κB的活化可以促发并加剧心肌肥厚、心功能恶化［11］。NF-κB能发挥细胞保护性的作用，在心肌梗死后心室重塑和心力衰竭中也发挥调节作用［12］。因此阻断NF-κB活性被认为是一个有前景的阻止有害的心梗后左室重塑途径。

急性心肌梗死后在体内的IL-1β表达是增加的，心肌坏死部位直接产生白介素-1β炎性因子，负责内皮系统的激活、白细胞聚集和炎症反应扩大化；IL-1β也可导致非心梗的部位心肌损害［13］；并可促进心肌纤维化和心肌肥大［14，15］。相应地，TNF-a也是增加的，持续存在的TNF-a导致心肌细胞的表型转变和MMPs活性增加，不断增加的TNF-a，抑制心肌收缩力、诱发心肌细胞凋亡和基质纤维增生，加剧了心室重塑的进程［16］。

本实验研究表明：正常人PBMC中就有NF-κB的微量表达，NF-κB染色多位于胞质中，核染色较少，已证实适量的NF-κB表达对人体组织的生长和维持内环境稳定起重要的调节作用。AMI患者的外周单个核细胞的NF-κB表达在3d明显高于正常人（见图），且心室重塑组与未重塑组无差别。这表明，在急性心肌梗死后大量炎症因子的刺激下，NF-κB与IκB解离，发生了核移位，促使NF-κB的过度表达。14d时，AMI后心室重塑组的患者NF-κB显著高于未重塑患者，两者比较有统计学意义，说明NF-κB在AMI后持续活化激活参与了心室重塑发生发展；未重塑组虽已下降，高于正常对照组，但已无统计学差异；另外，心室重塑组血浆细胞因子TNF-α、IL-1β的水平较心室未重塑组、对照组显著升高，并且NF-κB染色的阳性百分率与细胞因子 TNF-α、IL-1β的水平显著正相关，rTNF-α＝0.649，P＜0.01；rIL-1β＝0.535，P＜0.01（见表2）。心室未重塑组14d和对照组，核因子与肿瘤因子、白介素相关性较心室重塑组低，或无相关性（见表2）；这说明心室重塑组激活转录水平的NF-kB可以促进靶基因细胞因子TNF-α、IL-1β分泌来参与心室重塑及心力衰竭等病理生理过程。

另外本实验还发现，58例急性心肌梗死患者，行PCI者35例；发生左心室构（LVRM）的13例，未行冠脉介入术（PCI）者23例；发生LVRM的18例；经卡方检验χ2＝9.431，P＝0.002，P＜0.01。所以两组重塑发生率有差别。说明行尽早行PCI、恢复冠脉重建，有可能减少急性心肌梗死后心室重塑的发生率。

本实验采用细胞免疫细胞化学法，比较直观，可以清楚观察NF-κB p50，在胞质和细胞核内分布的情况，操作简便，可同时对NF-κB进行定位和半定量检测。但若对NF-κB精确地检测采用Western blont或EMSA法。

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