二乙酰姜黄素金属(铜,铂)配合物的合成及其与ctDNA的键合作用

姜 波， 魏 冬， 范九良， 汪佳凤， 周双生

(安徽中医学院 药学院，安徽 合肥 230031)

现代药理学研究表明，姜黄素不仅能行气、驱虫、散风活血、通经止痛等,常用于治疗皮肤病、鼻炎、肝胆疾患、风湿病，而且还具有抑制肿瘤细胞的生长和增殖、诱发肿瘤细胞凋亡等广泛的药理活性，毒性又小，是一种很有发展前景的抗肿瘤药物[1,2]。但由于其稳定性差、体内生物利用度低、用药量大而限制了其推广使用。

近年来研究发现，由于金属离子与DNA的某些亲核基团(如磷酸氧位点或碱基氮、氧位点)直接螯合，引起癌细胞的DNA损伤，使DNA在复制和转录时受到障碍，从而阻止了癌细胞的生长和分裂，并导致其死亡[3]。小分子与DNA之间的相互作用有三种方式(嵌插作用，沟槽作用和静电引力作用)，通过了解小分子与DNA键合作用机制，就能为以DNA为靶点的新型高效抗癌药物的设计提供指导性和可行性信息[4]。

为了进一步研究和探讨姜黄素类物质的生物活性，本文以姜黄素为起始原料，设计并合成了配体二乙酰姜黄素(H2L)及其金属[铜(Ⅱ)和铂(Ⅱ)]配合物(CuL2和PtL2， Scheme 1)，其结构经1H NMR， IR， MS和元素分析确认。采用紫外可见光谱法和循环伏安法研究了CuL2和PtL2与小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用。结果表明，CuL2和PtL2与ctDNA的作用属嵌插作用模式。

ML2(M=Cu， Pt)

Scheme1

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

UV-2450型紫外光谱仪；752PC型紫外分光光度计；Bruker 400 MHz型超导核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Nicolet Avatar 370DTGS型红外光谱仪(KBr压片)；Perkin-Elmer 2400CHN型元素分析仪；PHS-3CA型精密酸度计；CHI660B型电化学分析仪；LK2005A型电化学工作站。

姜黄素，国药集团；ctDNA, Sigma；其余所用试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

1．2 合成

(1) H2L的合成[6]

在圆底烧瓶中加入姜黄素1 g(2.7 mmol)，二氯甲烷75 mL，加热搅拌使其溶解；加入吡啶5 mL和乙酸酐8 mL(84.8 mmol)，回流反应3.5 h[溶液由橘红色变为淡黄色;TLC检测，展开剂：V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶1]。蒸除大部分溶剂后加甲醇100 mL，冷却析晶得黄色固体，用混合溶剂[V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=3 ∶2]重结晶得淡黄色晶体H2L，产率71.7%， m.p．157 ℃～158 ℃；1H NMRδ： 7.62～7.12(m, 6H, ArH)， 7.07～6.68(d，J=7.8 Hz, 4H， =CH)， 3.88(s， 6H, ArOCH3)， 2.39(s， 6H, COCH3), 2.26(s, 2H, CH2)； IRν： 1 712， 1 598, 1 508， 1 435, 1 254， 1 028； ESI-MSm/z： 452(M+)； Anal.calcd for C25H24O8： C 66.36， 5.35； found C 66.67， H 5.73。

(2) CuL2和PtL2的合成[7，8]

在圆底烧瓶中依次加入H2L 0.14 g(0.3 mmol)，无水乙醇35 mL及1 mol·L-1氢氧化钠溶液0.3 mL,搅拌下于室温滴加醋酸铜30.0 mg(0.15 mmol)的乙醇(3 mL)溶液，滴毕，回流(80 ℃)反应6 h。过滤，滤饼依次用二氯甲烷(3×15 mL)和水(3×15 mL)洗涤，于60 ℃真空干燥12 h得黄色粉末CuL2。

用四碘合铂酸钾代替醋酸铜，用类似方法合成棕色粉末PtL2。

CuL2： 收率74.5%， m.p．>280 ℃；1H NMRδ： 7.72～7.18(m, 6H, ArH)， 7.13～6.72(d，J=7.8 Hz, 4H， =CH)， 3.95(s， 6H, ArOCH3)， 2.45(s， 6H, COCH3), 2.30(s, 2H, CH2)； IRν： 1 593， 1 525， 1 507， 1 447, 1 297， 1 255， 1 195， 546 cm-1； Anal.calcd for C50H46O16Cu(Mr=965.5)： C 62.14， H， 4.80， Cu， 6.57； found C 61.88， H 5.02， Cu 6.62。

PtL2： 收率57.1%， m.p>280 ℃；1H NMRδ： 7.74～7.19(m, 6H, ArH)， 7.15～6.71(d，J=7.8 Hz, 4H， =CH)， 3.93(s， 6H, ArOCH3)， 2.46(s， 6H, COCH3), 2.31(s, 2H, CH2)； IRν： 1 592， 1 526， 1 508， 1 446, 1 295， 1 259， 1 196， 544 cm-1; Anal.calcd for C50H46O16Pt(Mr=1097.1)： C 54.70， H 4.22， Pt 17.76； found C 54.56， H 4.32， Pt 17.83。

1．3 CuL2和PtL2与ctDNA的相互作用测定

将配合物用混合溶剂A{5 mmol·L-1Tris-HCl[三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸]100 mL+50 mmol·L-1NaCl(pH 6.86)缓冲溶液900 mL}配成浓度(c)为1．0×10-4mol·L-1溶液。 ctDNA用A配成不同浓度的溶液，于4 ℃保存待用。 ctDNA在260 nm和280 nm处的吸光度比值为1.85，表明ctDNA达到实验要求[5]。

用混合溶剂A作空白对照液，测定时样品池和空白池分别装3 mL溶液,用微量注射器分别加入50 μL的ctDNA溶液，充分混合后静止5 min，在200 nm～350 nm内扫描，观察UV吸收曲线变化。

设置CHI660B电化学分析仪参数：扫描电压-1000 mV～1000 mV，扫描速率100 mV·s-1，扫描次数3次，间隔时间10 s。取Tris-HCl(pH 6.86)的NaCl缓冲溶液于电解池中，注入50 μL待测配合物溶液，浸入电极,通N2，搅拌5 min；在设置的条件下测定其未加ctDNA的循环伏安曲线;每次以递增方式加入50 μL的ctDNA溶液，共测3次，观察循环伏安曲线的变化。

2 结果与讨论

2．1 表征

H2L的IR分析结果表明，位于3 412 cm-1处的姜黄素酚羟基伸缩振动峰消失，只在1 712 cm-1和1 598 cm-1处出现羰基吸收峰，表明酚羟基上的氢已被乙酰基取代；在1 712 cm-1附近出现比较弱的吸收峰，是羰基的伸缩振动，强度很弱；1 598 cm-1附近是烯醇式异构体羰基伸缩振动，峰形强且尖锐。两个配合物的IR谱图相似，表明结构相似。CuL2的羰基伸缩振动吸收峰在1 593 cm-1(PtL2在1 592 cm-1)处，相对于L的烯醇式异构体的羰基峰稍稍蓝移，说明L以烯醇式异构体与M2+发生螯合配位，降低了羰基振动频率[9]；其次，L在1 028 cm-1附近的νO-H┈O烯醇式伸缩振动峰消失，而在1 525 cm-1附近处出现较强的νC=C伸缩振动峰，这是烯醇负离子发生M-O配位的特征[10]。另外，在CuL2中出现了新的546 cm-1峰(PtL2在544 cm-1)，归属于β-二酮的羰基氧与金属键合吸收峰[11]。配合物的1H NMR分析结果与H2L比较发现,形成配合物后,L的各种质子的化学位移均向低场发生了不同程度的位移,这也说明了L与M2+发生了配位作用[12]。

以DMF为溶剂，于25 ℃下在浓度为1.0×10-3mol·L-1溶液里测得CuL2和PtL2的摩尔电导值分别为27.8 s·cm2·mol-1和25.6 s·cm2·mol-1,表明它们均为非电解质。

结合元素分析和1H NMR结果，配合物的可能结构推断如Scheme 1所示。

2．2 CuL2和PtL2与ctDNA的键合作用

(1) UV-Vis法测定

λ/nm图1 CuL2与ctDNA在缓冲溶液(pH 6.86)中的UV-Vis谱图*Figure 1 UV-Vis spectra of CuL2 with ctDNA at pH 6.86 buffer solution*c(CuL2)=1.0×10-4 mol·L-1， c(ctDNA)=(0.0, 0.5, 1.0, 1.5)×10-4 mol·L-1

λ/nm图2 PtL2与ctDNA在缓冲溶液(pH 6.86)中的UV-Vis谱图*Figure 2 UV-Vis spectra of PtL2 with ctDNA at pH 6.86 buffer solution*同图1

E/V图3 CuL2与ctDNA在缓冲溶液(pH 6.86)中的循环伏安曲线*Figure 3 Cyclic voltammogram curve of CuL2 with ctDNA at pH 6.86 of buffer solution*同图1

E/V图4 PtL2与ctDNA在缓冲溶液(pH 6.86)中的循环伏安曲线*Figure 4 Cyclic voltammogram curve of PtL2 with ctDNA at pH 6.86 of buffer solution*同图1

图1和图2为CuL2和PtL2与ctDNA的键合作用UV-Vis光谱图。从图1和图2可见，随着c(ctDNA)增大，各配合物在275 nm和350 nm附近处的峰明显不断减小，且最大吸收波长表现出红移现象，按照Long E.C[13]理论，推测配合物与ctDNA键合作用属于嵌插模式。

(2) 循环伏安法测定

图3和图4为CuL2和PtL2与ctDNA的键合作用的循环伏安曲线。从图3和图4可见，小分子的伏安峰电位升高、正移，表明配合物与ctDNA作用是嵌入作用[14]，这与UV-Vis法结论相一致。另外，氧化还原峰电流(Ipa)随着c(ctDNA)的增加而逐渐降低，这是因为配合物结合了分子量大且扩散速率慢的ctDNA分子的缘故[15]。

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