快速测定红曲中γ-氨基丁酸含量的薄层色谱-比色法研究

李 利

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

陈 莎

(长江大学图书馆，湖北 荆州 434025)

赵 颖，陈福生

(华中农业大学食品科学与技术学院，湖北 武汉 430070)

快速测定红曲中γ-氨基丁酸含量的薄层色谱-比色法研究

李 利

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

陈 莎

(长江大学图书馆，湖北 荆州 434025)

赵 颖，陈福生

(华中农业大学食品科学与技术学院，湖北 武汉 430070)

通过对红曲中γ-氨基丁酸(GABA)的提取方法、薄层色谱(TLC)展开剂及其显色斑洗脱液的比色法测定波长及范围的研究，建立了一种简便、快速测定红曲中GABA含量的方法。结果表明，红曲中GABA最佳提取方法为水提法，TLC分离的最佳展开剂为95%乙醇︰25%氨水=4︰1，GABA显色斑洗脱液的最大吸收波长为512nm，在2～10μg范围内GABA的含量同洗脱液光密度的线性关系良好(R2=0.9983)。此方法对红曲样品中GABA的测定结果与高效液相色谱法一致性好，回收率为91.00%～96.33%，适合于大批量菌株筛选和发酵条件优化实验中GABA含量的定量分析。

红曲；γ-氨基丁酸；薄层色谱；分光光度法

红曲亦名丹曲，是以大米为原料，经红曲菌(Monascusspp.)发酵而成的米曲。红曲在我国的应用至今已有一千多年的历史，它广泛用于酿酒、食品着色、发酵及中药等方面[1]。

γ-氨基丁酸(GABA)被认为是红曲中降压的主要成分[2-4]。研究证明，GABA是哺乳动物中枢神经系统的抑制性神经递质，是一种生理活性物质，能够降低血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、改善脑机能、增加生长激素分泌，以及改善更年期综合症等[3,5-6]。

由于GABA对于电化学和紫外、可见光等不灵敏，因此，对其进行直接检测存在一定困难。目前，国内外报道的GABA检测方法有高效液相色谱法[5,7]、毛细管电泳法[8]、放射受体法[9]、酶法[10]、纸层析法[11]等，但这些方法大多价格昂贵，多应用于医学领域。本研究针对红曲中的GABA含量的测定，建立了一种简便、低廉、快速测定食品中GABA含量的TLC-比色法。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

红曲米为自制，具体方法参照文献[12]。将制备好的红曲米在45℃下烘干至恒重，粉碎过40目筛备用。

展开剂1：V(正丁醇)︰V(冰醋酸)︰V(水)=4︰1︰1；展开剂2：V(正丁醇)︰V(冰醋酸)︰V(水)=4︰1︰3；展开剂3：V(95%乙醇)︰V(氨水)=9︰1；展开剂4：V(95%乙醇)︰V(25%氨水)=4︰1。

显色剂为0.2%茚三酮乙醇溶液。洗脱剂采用75%乙醇︰30g/L CuSO4溶液=15︰1。

主要仪器有YUKO-TF薄层涂敷器、岛津UV-1700型紫外可见光谱仪和岛津SPD 10AVP型高效液相色谱仪等。

1.2 方法

1.2.1 提取方法的比较试验

根据马莉锋等[5]报道的红曲中GABA提取方法，参考国内关于红芪、米胚芽等GABA的提取方法[11,13-14]，设计以下2种提取方案。

(1)水提取法 准确称取红曲粉2.00g置于50ml离心管中，加15ml蒸馏水，混匀，30℃下150r/min摇床振摇过夜，5000r/min离心，取上清用20ml氯仿分2次萃取，合并水层，40℃水浴浓缩至干，加2ml蒸馏水溶解备用。

(2)乙醇提取法 准确称取红曲粉2.00g置于50ml离心管中，加15ml 60%乙醇，混匀，30℃下150r/min摇床振摇过夜，5000r/min离心，取上清40℃水浴浓缩至干，加2ml蒸馏水溶解备用。

1.2.2 薄层色谱分离时展开剂的选择试验

硅胶H与0.7%的羧甲基纤维素钠按1︰3(W︰V)的比例调成糊状，用涂敷器铺成0.5mm厚的层析板(10cm×13cm)，自然干燥后于105℃活化30min，放于干燥器中待用。

将GABA标准溶液和样品溶液以点状或线状点样于硅胶H层析板，分别使用上述4种展开剂展开，展距10cm。随后置层析板于通风橱中吹干，然后以0.2%茚三酮乙醇溶液喷雾，90℃显色10min。其中选用含氨水的展开剂3和4时，在通风橱中吹干后需要进一步于90℃烘箱保温30min以挥尽氨气，避免层析板上残余的氨与茚三酮发生显色反应后形成红色的背景干扰色。

1.2.3 比色分析时波长的选择试验

将GABA标准溶液和样品溶液以线状点样于层析板，按1.2.2的方法用V(95%乙醇)︰V(25%氨水)=4︰1为展开剂展开并显色，用薄塑料片刮下显色带处的硅胶，收集后置于10ml离心管中，加1.6ml洗脱液进行洗脱，5000r/min离心10min，上清用200μl微量比色皿(光程L=1cm)在480～600nm进行扫描，测定吸收曲线，根据最大吸收峰的位置确定测定波长。

1.2.4 测定范围的确定

取5～70μl 0.2μg/μl的GABA标准品溶液，每10μl在硅胶H层析板上点成1cm长的线状点样带，按1.2.3的方法展开、显色并洗脱，测定显色带洗脱上清液的光密度D512nm，得到GABA含量与光密度D512nm之间的关系，根据线性范围确定方法的测定范围。

1.2.5 回收率试验

准确称取2.00g红曲粉置于50ml离心管中，一组加入GABA标准品600μg (加标量300μg/g)，另一组不加GABA标准品，每组设置3个平行，按1.2.1的水提法进行提取，提取液按1.2.3的方法展开、显色、洗脱并测定洗脱上清液的光密度D512nm，根据标准曲线计算GABA含量。依据加标量、加标准品和未加标准品的测定结果，计算方法的回收率。

1.2.6 精确度试验

选取2个GABA含量不同的红曲样品，分别采用TLC-比色法和HPLC法测定其GABA含量，通过比较TLC-比色法与反相高效液相色谱法的测定结果，计算TLC-比色法的精确度。

GABA的反相高效液相色谱测定参考文献[7]。样品提取液用0.1mol/l碳酸钾缓冲液稀释适当倍数，0.22μm微孔滤膜过滤。每1ml过滤后的样品稀释液加入500μl OPA衍生液进行衍生。色谱条件: 色谱柱为Kromasil C18(5μm,250.0mm× 4.6mm) ; 流动相为磷酸钾缓冲液( 0.1mol/l，pH6.0)∶甲醇∶乙腈体积比为6∶3∶1; 检测器为荧光检测器，荧光激发波长Ex = 340nm，发射波长Em = 455nm; 流速0.6ml/min；进样量20μl。

2 结果与分析

2.1 提取方法的选择

采用醇提法和水提法分别对红曲中GABA进行提取，结果显示，乙醇提取液中红色色素含量较高，呈深红色(表1)。由于薄层色谱分析时，GABA等氨基酸用茚三酮溶液喷雾显色后亦呈红色，故随展开剂展开的红色色素对GABA的显色斑有较严重地干扰。相比之下，水提法色素干扰较少，TLC分离时氨基酸的显色斑清晰，故在后续实验中选用水提法提取红曲中的GABA。

表1 2种提取方法比较

2.2 展开剂的选择

关于层析法分离分析氨基酸，不同文献使用不同的展开剂和配比。张晖等[11]用纸层析分析米胚芽中GABA含量时，比较了几种展开剂配方，发现展开剂V(正丁醇)︰V(冰醋酸)︰V(水)=4︰1︰3能够很好地将米胚芽提取物中的GABA同其他氨基酸分开。本研究中发现不同配比的正丁醇-冰醋酸-水展开剂对红曲提取液中氨基酸的分离效果很差，展开后的氨基酸显色斑连成一片，GABA无法同其他氨基酸分开，可能是红曲中氨基酸组成和含量与米胚芽中存在较大差异所致。因此，进一步研究了不同配比的乙醇-氨水展开剂的分离效果，发现展开剂V(95%乙醇)︰V(25%氨水)=4︰1能很好地将提取液中GABA与其它氨基酸分开。故在后续实验中选用展开剂V(95%乙醇)︰V(25%氨水)=4︰1。

2.3 测定波长的选择

图1 GABA显色斑洗脱液吸收曲线

将在硅胶H层析板上收集的GABA显色带采用洗脱液进行洗脱后，上清在480～600nm进行扫描，发现GABA显色带洗脱液在512nm处有最大吸收峰(图1)，因此，后续实验中GABA洗脱液的光密度均在512nm处测定。

图2 GABA含量与洗脱液光密度D512nm的关系

2.4 测定范围的确定

取1、2、4、6、8、10、12、14μg GABA标准品点样于硅胶H层析板，展开后显色并测定显色带洗脱上清液的光密度D512nm，得到GABA含量与光密度D512nm之间的关系(图2)。由图2可知，当点样量在10μg内时，D512nm与GABA的含量呈线性关系，其中在2～10μg范围内，GABA的含量与D512nm之间线性关系良好，以D512nm(Y)对GABA质量(X)进行回归，回归方程为Y=0.0439X+0.1219，R2= 0.9983。

2.5 方法的回收率

选取2个GABA含量不同的红曲样品，按1.2.5的方法进行加标回收试验，结果见表2。由表2可知，该方法的回收率在91.00%～96.33%之间，平均值为93.50%，相对标准偏差为2.03%。

2.6 方法的精确度

选取2个GABA含量不同的红曲样品，分别采用TLC-比色法和HPLC法测定其GABA含量，结果发现2种方法测定结果一致性较好，TLC-比色法的测定值约为HPLC测定值的92.45%(表3)，可见TLC-比色法有较好的精确度，可用于红曲中GABA的定量分析。

3 讨论与小结

GABA是一种具有生理活性的氨基酸。近年来，GABA在保健食品中的应用研究逐渐兴起，选育高产GABA的微生物及其发酵条件的优化是其重要研究方向之一[2,7,15-17]。氨基酸自动分析仪、高效液相色谱仪等现代分析仪器可以快速准确地测定GABA的含量，但由于菌种选育和发酵条件优化的研究中需要测定的样品多、工作量大，而且容易受研究经费、设备条件等因素限制，所以此类方法难以在一般的实验室普及。因此，建立一种简便、快速准确、能大批量测定样品中GABA的方法意义重大。

红曲菌固态发酵产物红曲的成分比较复杂，色素含量高，氨基酸种类也较多，GABA的提取和分析难度较大。本研究采用水浸提法提取红曲中的GABA，能有效避免醇溶性红曲色素的干扰，再采用氯仿萃取法除去部分水溶性色素，最终的提取液色素含量少，TLC分离时氨基酸的显色斑清晰。为了简便、快速地测定红曲提取液中GABA含量，本研究将TLC和分光光度法相结合，先采用TLC分离样品中的GABA，经茚三酮显色得到稳定的红色色斑，这样一方面可以直接根据显色斑的大小和颜色深浅进行定性和半定量分析，另一方面可收集GABA显色斑进行洗脱，通过比色法测定洗脱液的光密度进行定量分析。

表2 TlC-比色法测定GABA的回收率

表3 TLC-比色法与HPLC的测定结果比较

本研究结果表明，采用TLC-比色法定量测定GABA含量时，最佳展开剂为95%乙醇︰25%氨水=4︰1，测定波长为512nm，线性范围为2～10μg，方法的回收率在91.00%～96.33%之间，其测定结果与HPLC测定结果相比精确度达92.45%。该方法适合于大批量菌株筛选和发酵条件优化实验中GABA含量的定量分析。

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2012-11-22

李 利(1983-)，湖北浠水人，博士，讲师，主要从事微生物学的教学与研究。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.12.008

TS201.2

A

1673-1409(2012)12-S023-04