米诺环素对脑缺血再灌注后大鼠细胞凋亡的影响

熊建忠 易 飞 揭文环 (萍乡市人民医院神经内科，江西 萍乡 337000)

米诺环素对脑缺血再灌注后大鼠细胞凋亡的影响

熊建忠 易 飞 揭文环 (萍乡市人民医院神经内科，江西 萍乡 337000)

目的 观察米诺环素对脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响。方法 30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组、预处理组、30 min组、4 h组，每组6只。采用线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注模型。用RT-PCR、免疫组化、Hoechst染色、核磁共T2WI成像等方法，了解米诺环素对缺血后细胞凋亡的影响。结果 脑缺血后caspase-3、ICE表达增强，半暗带区凋亡细胞增多，T2WI扫描在缺血侧可见大片异常信号区。预处理组、30 min、4 h组caspase-3、ICE表达减少，细胞凋亡百分率下降，脑缺血体积缩小。结论 米诺环素能减轻缺血后细胞凋亡。

脑缺血再灌注;米诺环素;凋亡

脑缺血严重危害着人类生命和健康，其病理机制十分复杂。细胞凋亡在脑缺血损伤中发挥着重要的作用。在缺血性脑损害中，坏死主要发生在缺血中心，而凋亡多位于半暗带，是一种迟发的神经元死亡。神经元凋亡是一种由基因控制的细胞主动死亡过程，在不同的刺激信号的影响下，涉及多个基因表达及相互作用的复杂过程。本文将从凋亡调节蛋白酶ICE、caspase-3及Hoechst染色及脑细胞缺血体积等方面，研究米诺环素对脑缺血再灌注损伤后凋亡的影响，及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器

微镜：日本Nikon公司。ICERT-PCR试剂盒：上海生物工程技术有限公司;Hoechest33258染色液：上海碧云天生物技术公司;caspase-3抗体：广州森达生物技术公司。米诺环素：中国惠式制药公司。

1.2 实验分组

雄性SD大鼠30只，体重250～300 g，中南大学动物实验中心提供。实验分为5组：假手术组(术后30 min腹腔注射米诺环素45 mg/kg)，生理盐水组(脑缺血后30 min腹腔注射等量的生理盐水)，预处理组(脑缺血前12 h腹腔注射米诺环素45 mg/kg)，30 min组(脑缺血后30 min腹腔注射米诺环素45 mg/kg)，4 h组(脑缺血后4 h腹腔注射米诺环素45 mg/kg)。

1.3 脑缺血再灌注模型的制作

血再灌注模型。大鼠用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，颈部正中切口，钝性分离，暴露右颈总、颈内和颈外动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉。在颈总动脉分叉处剪一小口，沿颈内动脉向颅内插入鱼线(18.5±1.5)mm。栓塞90 min后将鱼线拔出。假手术组鱼线插入深度为10 cm，余步骤相同。

1.4 取材和免疫组化染色

大鼠缺血再灌注24 h后，用10%的水合氯醛麻醉，等渗生理盐水和4%多聚甲醛PBS液进行心脏灌注，断头取脑，取距嗅球尖端7～11 mm间的脑组织块，置于4%多聚甲醛中固定，脱水，包埋，连续切片，片厚6 μm。免疫组织组化染色严格按照说明书进行。

1.5 Hoechst染色

切片常规脱蜡透明后，置于六孔板上以0.9%生理盐水洗3遍，每次3 min，吸尽液体，然后加入0.5 ml的Hoechst染色液，手摇晃动以充分染色，染色5 min，完成后将切片置于载玻片上，滴上1滴抗淬灭液，盖上洁净的盖玻片，在荧光显微镜下观察神经细胞凋亡形态并进行拍照。

1.6 核磁共振扫描

采用美国GE 1.5 T超导MRI成像设备，3英寸表面线圈为接收线圈。大鼠脑缺血再灌注24 h后行T2WI扫描。将麻醉的大鼠俯卧位，头部置于线圈中央。先扫描定位像，自嗅沟水平向尾侧作连续冠状位扫描。扫描参数：T2WI：TR/TE/NEX 4200/15.7/6，层厚3 mm，层间隔0 mm，FOV 8 cm×8 cm。MRI原始数据传入工作站，病变和脑半球体积测量由同一名影像专业医师在同一天完成。

1.7 结果分析

caspase-3阳性细胞判断标准：细胞质染成棕黄色，部分核着色。每张切片选取5个视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析光密度值。细胞凋亡百分率：切片Hoechst染色后在荧光显微镜下观察，并摄片，用Image-Pro Plus 6.0软件分析，计算出细胞凋亡百分率。脑缺血体积的测量：将图像放大并优化窗宽窗位后，运行体积分析软件，计算各层数

以Longa改良法制备大鼠缺

1.5T核磁共振：美国GE公司;荧光显据与层厚的积，累加得到体积。测量缺血同侧半球体积(HVi)、对侧半球体积(HVc)和病变体积(LV)，求得校正后缺血病变体积比=(HVc-HVi+LV)/HVc×100%。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 casepase-3免疫组化表达

免疫组化结果显示：caspase-3阳性细胞主要位于梗死灶边缘。假手术组可见少量casepase-3阳性细胞。生理盐水组缺血灶周围可见大量caspase-3染色阳性细胞。与假手术组相比，其平均光密度值增高，差别有显著性意义。与生理盐水组相比，预处理组、30 min组、4 h组平均光密度值下降(P＜0.01)。见表1、图1。

表1 各组大鼠的caspase-3光密度值及细胞凋亡百分率(s)

表1 各组大鼠的caspase-3光密度值及细胞凋亡百分率(s)

为各组与生理盐水组相比：1)P＜0.01

组别 n 细胞凋亡百分率(%) caspase-3光密度值生理盐水组6 4.733±3.095 0.436±0.081假手术组 6 27.900±7.4391) 0.174±0.0391)预处理组 6 13.200±5.1021) 0.304±0.0851)30 min组 6 12.700±4.3881) 0.289±0.0831)4 h组 6 15.667±6.3701) 0.343±0.0941)

2.2 Hoechst 染色结果

在荧光显微镜下正常细胞发出的荧光较微弱，凋亡细胞的细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒凝块荧光及明显核形态变化，发出强亮的荧光。假手术组大脑皮层只有少量凋亡细胞，生理盐水组在脑缺血灶周围中可见大量凋亡细胞，与假手术组相比，差别有显著性意义(P＜0.05，P＜0.01)。预处理组、30 min、4 h组细胞凋亡百分率下降，与生理盐水组相比差别有显著性意义。见表1、图1。

2.3 核磁共振T2WI成像

假手术组核磁共振T2WI扫描，无异常信号。生理盐水组T2WI扫描在缺血侧可见大片高信号区。与生理盐水组相比，预处理组、30 min、4 h组相对脑缺血体积减少，差别有统计学意义。见表2、图1。

2.4 ICE的表达

达，生理盐水组在缺血半暗带ICE表达增强，与假手术组相比，差别有统计学意义。预处理组、30 min、4 h组ICE的表达降低，与生理盐水组相比，差别有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。见表 2、图 2。

假手术组大鼠的大脑皮层只有少量ICE表

表2 各组大鼠相对脑缺血体积及ICE O/D值±s)

表2 各组大鼠相对脑缺血体积及ICE O/D值±s)

与生理盐水组相比：1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 脑缺血体积(%) 的表达(O/D值)生理盐水组6 28.568±5.180 1.478±0.460假手术组 6 0.000±0.0002) 0.214±0.0641)预处理组 6 15.465±3.5081) 0.426±0.1441)30 min组 6 16.358±3.7531) 0.463±0.1531)4 h组 6 17.102±2.6371) 0.485±0.1351)

图1 生理盐水组caspase-3免疫组化染色、hoechst染色、T2WI成像

图2 各组ICE mRNA表达

3 讨论

ICE是caspase家族中最早克隆的凋亡相关基因。ICE能使IL-1β前体转化成为成熟形式，ICE对脑缺血凋亡的调节是通过IL-1β发挥作用〔1〕。成熟的 IL-1β促进凋亡的发生，是凋亡的增强因子〔2〕。caspase-3是caspase级联反应中最关键的蛋白酶，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路〔3〕。活化的caspase-3可裂解多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，DNA的损伤不能正常修复，引起核固缩，DNA裂解，凋亡小体形成。

Hoechst染色后在荧光显微镜下能迅速区分出正常细胞与凋亡细胞，被广泛地用于细胞凋亡研究。脑缺血后脑梗死体积是脑卒中实验研究中的一个重要预后参数，而且与细胞凋亡密切相关。而MRI是一种可与其他方法兼容的、可重复性完成活体测量的方法。米诺环素是一种半合成的第二代四环素衍生物，它可顺利通过血脑屏障，在中枢神经系统米诺环素可以达到有效的临床治疗药物浓度水平〔4〕。近来动物模型研究发现米诺环素具有抗微生物特性外，还具有抑制炎症反应、细胞凋亡等作用。

本实验结果显示：脑缺血再灌注损伤后24 h，缺血半暗带区caspase-3、ICE表达明显增强，凋亡细胞增多。T2WI检测可见缺血侧大片高信号强度区。在大鼠脑缺血前12 h，缺血后30 min，甚至在脑缺血后4 h给大鼠腹腔注射米诺环素(45 mg/kg)能明显降低脑缺血后caspase-3、ICE的表达，细胞凋亡百分率及脑缺血体积。本试验结果进一步证实米诺环素在脑缺血前后一定时间段给药具有抗细胞凋亡作用，与Arvin等〔5〕研究结果相一致。

米诺环素的抗凋亡作用可能与阻止细胞内Ca2+超载、细胞色素C和Smac/Diablo的释放，缩小线粒体的皱缩和肿胀，抑制线粒体的死亡有关。同时米诺环素还能抑制ICE和caspase-3的表达及ICE和caspase-3的活性;另外，米诺环素还能抑制小胶质细胞激活，稳定线粒体膜，减少线粒体对Cyt-C，Smac/Diablo和 AIF 的通透性〔6〕，上调抗凋亡因子 bcl-2〔7〕。米诺环素可以通过JNK通路抑制神经元的凋亡。米诺环素能还通过抑制缺血后COX-2、前列腺环素E2等的表达减少自由基的产生，达到抑制细胞凋亡的作用。米诺环素可通过caspase途径和非caspase 途径抑制缺血后细胞凋亡〔8，9〕。

综上所述，米诺环素能减轻脑缺血再灌注损伤所引起的细胞凋亡。米诺环素作为一种新型抗生素，具有高亲脂性，有极好的组织渗透性，能广泛分布于身体各组织及体液中，故被广泛地用于临床，且长期大剂量使用，被证明是安全的。故米诺环素有望作为新的脑保护药在防治脑梗死中发挥作用。但目前对米诺环素的研究大多停留在动物实验阶段，其临床效果还需要更多的实验加于证实。

1 Morancho A，Rosell A，Garcia-Bonilla L，et al.Metalloproteinase and stroke infarct size：role for anti-inflammatory treatment〔J〕?Ann N Y Acad Sci，2010;1207(5)：123-33.

2 Zhang Q，Chen C，Lu J，et al.Cell cycle inhibition attenuates microglial proliferation and production of IL-1beta，MIP-1alpha，and NO after focal cerebral ischemia in the rat〔J〕.Glia，2009;57(8)：908-20.

3 D'Amelio M，Cavallucci V，Cecconi F.Neuronal caspase-3 signaling：not only cell death〔J〕.Cell Death Differ，2010;17(26)：1104-14.

4 Yrjanheikki J，Keinanen R，Pellikka M，et al.Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1998;95：15769-74.

5 Arvin KL，Han BH，Du Y，et al.Minocycline markedly protects the neonatal brain against hypoxic-ischemic injury〔J〕.Ann Neurol，2002;52(1)：54-61.

6 Zhu S，Stavrovskaya IG，Drozda M，et al.Minocycline inhibits cytochrome c release and delays progression of amyotrophic lateral sclerosis in mice〔J〕.Nature，2002;417(1)：74-8.

7 Wang J，Wei Q，Wang CY，et al.Minocycline up-regulates Bcl-2 and protects against cell death in mitochondria〔J〕.J Biol Chem，2004;279(19)：19948-54.

8 Scarabelli TM，Stephanou A，Pasini E，et al.Minocycline inhibits caspase activation and reactivation，increases the ratio of XIAP to smac/DIABLO，and reduces the mitochondrial leakage of cytochrome C and smac/DIABLO〔J〕.J Am Coll Cardiol，2004;43(5)：865-74.

9 Suk K.Minocycline suppresses hypoxic activation of rodent microglia in culture〔J〕.Neurosci Lett，2004;366(1)：167-71.

Effect of minocycline on neuronal apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion rats

XIONG Jian-Zhong，YI Fei，JIE Wen-Huan.
Department of Neurology，the People's Hospital of Pingxiang，Pingxiang 33700，Jiangxi，China

Objective To explore the effect of minocycline on the neuronal apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods 30 healthy male SD rats were randomly divided into sham，control，minocycline preconditioning，30 min，4 hour groups(n=6).Middle cerebral artery occlusion in rats was established with the suture method.Minocycline on the neuronal apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats was detected with immunohistochemistry，reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)，Hoechst stain and T2WI.Results Lots of caspase-3 protein positive cells were seen in the area adjacent to ischemia and the expression of the interleukin-1β converting enzyme(ICE)was increased significantly in control group.Apoptotic cells were increased significantly in control group.There were large abnormal signal areas in control group when cerebral ischemic areas were visualized with T2-weighted.The relative infarction volumes was decreased，the expressions of the ICE and caspase-3 also were decreased in minocycline preconditioning，30 min and 4 hour groups.In those groups minocycline was treated at 12 h before ischemia and 30 min，4 h after the onset of ischemia，the rate of apoptotic cells was significant lower than that of control group.Conclusions Minocycline could ameliorate the neuronal apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion.

Cerebral ischemia-reperfusion;Minocycline;Apoptosis

R749

A

1005-9202(2012)23-5203-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.046

江西省科技计划支撑项目(No.SB01800)

熊建忠(1974-)，男，副主任医师，博士，主要从事脑血管疾病研究。

〔2011-07-25收稿 2012-01-10修回〕

(编辑 曹梦园)