内毒素血症大鼠膈肌功能障碍和肌浆网钙泵基因表达的变化

方迎艳 郭晓磊 马 丽 高 琴 叶红伟 关宿东 (蚌埠医学院生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

内毒素血症大鼠膈肌功能障碍和肌浆网钙泵基因表达的变化

方迎艳 郭晓磊 马 丽1高 琴 叶红伟 关宿东 (蚌埠医学院生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

目的 探讨内毒素血症大鼠膈肌功能和膈肌肌浆网钙泵基因(SERCA)表达的变化。方法 直接采用腹腔注射内毒素12 mg/kg建立大鼠内毒素血症模型，32只成年雄性SD大鼠随机分成四组：生理盐水对照组和内毒素24 h组，48 h组，96 h组，即分别在注射内毒素24、48、96 h后处死大鼠，应用体外灌流大鼠膈肌条的方法，分别测量其单收缩张力(Pt)、最大强直张力(Po)、峰值收缩时间(CT)、半舒张时间(1/2RT)、张力-频率曲线，电镜观察大鼠膈肌超微结构，采用RT-PCR检测大鼠膈肌SERCA mRNA表达。结果 大鼠膈肌的各项力学指标：单收缩张力和最大强直张力，内毒素血症组较对照组明显降低(P＜0.01);单收缩的峰值收缩时间和半舒张时间，内毒素血症组较对照组明显延长(P＜0.01);在给予大鼠膈肌条10、20、40、60、100 Hz刺激时，内毒素血症组的大鼠膈肌各频率下的收缩张力明显低于对照组(P＜0.01);超微结构显示内毒素对大鼠膈肌组织损伤明显，肌纤维断裂，肌浆网扩张，线粒体水肿，数目减少，脊断裂，空泡化或囊泡化;RT-PCR检测实验结果提示内毒素血症大鼠膈肌SERCA表达较对照组明显降低(P＜0.01)。结论 内毒素可损伤大鼠膈肌超微结构，导致膈肌收缩和舒张功能障碍，并引起膈肌SERCA基因表达明显降低。

内毒素;膈肌;肌浆网钙泵

膈肌功能障碍在呼吸衰竭中发挥重要的作用。内毒素降低膈肌蛋白质合成〔1〕，尤其降低基本的快肌纤维蛋白合成〔2〕，还引起膈肌肌浆网Ca2+释放机制发生功能障碍，Ryanodine介导的Ca2+释放明显降低〔3〕。本实验进一步研究内毒素血症大鼠膈肌超微结构和肌浆网钙泵(SERCA)基因表达改变，探讨内毒素血症中膈肌功能障碍的相关发生机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

32只成年雄性SD大鼠随机分成4组：生理盐水对照组和内毒素24 h组，48 h组，96 h组，即内毒素腹腔注射12 mg/kg，分别在注射内毒素后 24 h，48 h，96 h 处死大鼠〔4〕。

1.2 药物和主要试剂

沙门氏菌属精制内毒素L-2880购自Sigma公司;总RNA提取试剂(Trizol)购自Invitrogen公司;反转录试剂盒购自Fermentas公司;PCR扩增试剂盒购自Fermentas公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)上海生工生物工程有限公司;琼脂糖、EB(溴乙锭)、溴酚蓝购自上海生工生物工程有限公司;75%乙醇、冰乙醇均为国产分析纯试剂。

1.3 主要仪器

生物信号采集处理系统(MedLab-U/4C，南京美易科技有限公司);张力换能器(JZ100，高碑店市新航机电设备有限公司);透射电子显微镜(JEM-1230，日本);GIS凝胶成像分析系统(TanonGIS-1000，上海天能科技有限公司);黑金刚基因扩增仪(EDC-810，北京东胜创新生物科技有限公司);多功能暗箱式紫外透射仪(ZF-90型，上海顾材电光仪器厂);琼脂糖水平电泳槽(DYY-III32型，北京六一仪器厂);电泳仪(DY-A，上海生化所申华生化技术开发公司)。

1.4 膈肌标本的处理

水合氯醛麻醉断头处死大鼠，速取右侧膈肌，制备膈肌条，剩余取一块用2.5%戊二醛固定，制备电镜标本。左侧膈肌在冰生理盐水漂洗后称量膈肌100 mg，液氮速冻后在-80℃低温冰箱中保存待行RT-PCR检测。

1.5 膈肌超微结构检测

将膈肌切成1 mm3组织块，立刻固定到2.5%戊二醛，4℃冰箱保存。1%锇酸后固定，梯度脱水包埋后，超薄切片(片厚70 nm)，铜网捞片，电子染色(铅、铀染色)，用日产JEM-1230型透射电镜观察，数码相机记录图像。

1.6 膈肌力学指标的检测

1.6.1 收缩特性〔5〕将置备好的膈肌条垂直悬挂于盛满Kerb(95%O2和5%CO2)液的麦氏浴槽中，膈肌条的肋骨端用蛙心夹固定在浴槽底部，中心腱端用缝线结扎并连接于张力换能器。张力换能器固定在微调节器上，以便调节膈肌肌条的初长度。调节肌条长度至产生单收缩力最大时，即肌条处于最适初长度(L0)，将其静置平衡20 min，各项力学指标检测均在L0下进行。麦氏浴槽置于数控超级恒温槽中并保持30℃。电子刺激器通过两根放置在肌条两侧的铂金丝电极(电极间距约0.4 cm)以超最大电压直接刺激膈肌(刺激强度增加至单收缩力最大时，然后再增加至其数值的130%，即超最大电压约20 V)。张力传感器的输出信号由生物信号采集处理系统记录分析。每个肌条测定两次在L0时的单收缩张力(Pt)、峰值收缩时间(CT)、半收缩时间(1/2RT)，每次刺激(刺激参数：超最大电压20 V，波宽2 ms)间隔2 min，以两次平均值作为测定值。

1.6.2 最大强直收缩力(PO) 在单收缩刺激后静置10 min以超最大电压，波宽2 ms，串长400 ms，频率100 Hz刺激获得一个清晰坪。两次刺激平均值作为测定值，间隔2 min。

1.6.3 张力-频率曲线测定〔6〕刺激参数参照最大强直收缩力的参数，以 10，20，40，60，100 Hz刺激下的膈肌收缩张力绘出张力-频率曲线。其值与Pt、PO的值均由膈肌肌条的横截面积(CSA)标准化后表示(单位：g/cm2)。CSA(cm2)=肌条重量(g)/肌条长度(cm)×膈肌肌肉条密度(g/cm)，膈肌肌肉条密度以1.056 g/cm3计算。

1.7 RT-PCR检测SERCA mRNA表达的变化

1.7.1 引物序列设计与合成 通过检索基因文库中大鼠目的基因SERCA、与内参β-actin的mRNA序列进行引物设计，引物由上海生工生物工程有限公司合成。大鼠β-actin上游引物：5'-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGAC-3'下游引物：5'-GCTCATTGCCGATAGTGA TGACT-3'，全长630 bp;SERCA上游引物：5'-AAGCAGTTCATCCGCTACCT-3'下游引物：5'-AGACCA TCCGTCACCAGATT-3'，全长134 bp。

1.7.2 总RNA的提取 取100 mg膈肌组织采用Trizol法提取膈肌肌组织总RNA，经紫外分光光度仪分析A260/A280，要求全部样本的OD260/OD280比值在1.8～2.0。

1.7.3 RNA的逆转录与基因扩增 3 μg总RNA行逆转录。cDNA产物作β-actin、SERCA浓度和循环梯度周期曲线。总反应体系 25 μl，包括上述合成的 cDNA 3 μl，PCR Master Mix(2 × )12.5 μl，上、下游引物各 1 μl，加无核酸酶水 7.5 μl。PCR仪上扩增，反应条件：95℃预变性3 min后，以95℃ 50 s变性，β-actin退火温度59.5℃，50 s;SERCA退火温度58.2℃，50 s;72℃ 60 s，反应30个循环，最后一轮延伸10 min。PCR产物判定：取5 μl扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳(电压按100 V，电流40 mA)，EB显色，结果使用图像分析软件行灰度扫描作半定量分析，以SERCA与β-actin吸光度值的比作为SERCA mRNA表达半定量值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 透射电镜显示各组大鼠膈肌超微结构的变化

对照组大鼠膈肌肌纤维密集，排列整齐，肌节清晰，细胞膜完整，线粒体呈圆形或椭圆形整齐排列，数量密集，无肿胀。内毒素血症大鼠膈肌细胞肌纤维肿胀，坏死溶解，横纹消失，肌丝紊乱;线粒体数量减少，水肿扩张，线粒体空泡化或囊泡化;肌浆网明显扩张，肿胀。见图1。

2.2 膈肌的收缩特性

与对照组相比，内毒素血症大鼠膈肌的Pt及Po明显下降(P＜0.01);CT与1/2RT明显延长(P＜0.01);内毒素96 h组与24 h组、48 h组的各项指标有不同程度的差异性(P＜0.05)。见表1。

2.3 膈肌收缩的张力-频率关系

在给予大鼠膈肌条10、20、40、60和100 Hz刺激时，内毒素血症大鼠膈肌各频率下的收缩张力明显低于对照组(P＜0.01);在100 Hz刺激时，内毒素96 h组、48 h组膈肌收缩张力较内毒素24 h组出现明显降低(P＜0.05)。见表2。

2.4 膈肌SERCA mRNA的表达

提取总RNA吸光度(OD260/OD280)的比值为1.8～2.0，纯度满足实验要求。结果显示大鼠膈肌SERCA mRNA/β-actin mRNA的比值，内毒素24 h组(0.65±0.12)、48 h组(0.50±0.09)和96 h组(0.42±0.09)较对照组(0.94±0.04)显著降低(P＜0.01)，见图2，内毒素48 h组和96h组较内毒素24 h组也明显降低(P＜0.01)。见图2。

表1 各组大鼠膈肌收缩功能的比较(n=8s)

表1 各组大鼠膈肌收缩功能的比较(n=8s)

与对照组比较：1)P＜0.01;与内毒素24 h组比较：2)P＜0.05;与内毒素48 h组比较：3)P＜0.05;与内毒素96 h组比较：4)P＜0.05，下表同

组别 Pt(g/cm2) Po(g/cm2) CT(ms) 1/2RT(ms)对照组 230.59±83.03 865.60±335.71 38.56±5.55 29.69±4.14内毒素24 h组 111.33±15.911)4) 550.28±152.601)3)4) 68.00±12.351) 46.26±11.101)3)4)内毒素48 h组 91.21±12.421) 351.90±100.471)2) 62.41±6.221)4) 63.20±6.591)2)4)内毒素96 h组 56.98±8.071)2) 253.04±59.181)2) 75.13±7.971)3) 80.88±7.641)2)3)

图1 各组大鼠膈肌超微结构(×20 000)

表2 大鼠膈肌在各刺激频率下收缩力的变化(g/cm2，n=8±s)

表2 大鼠膈肌在各刺激频率下收缩力的变化(g/cm2，n=8±s)

组别刺激频率(Hz)10 20 40 60100对照组 143.99±112.81 245.92±201.85 461.79±144.49789.76±288.68 896.98±269.28内毒素24 h组 107.22±45.811) 206.05±104.791) 353.04±61.661) 278.22±17.631) 430.30±62.421)3)4)内毒素48 h组 64.21±29.691) 93.07±21.91) 194.83±23.341) 210.52±60.361) 259.80±62.791)2)内毒素96 h组 46.09±8.961) 83.48±8.921) 147.89±14.11) 180.49±27.741) 216.93±29.271)2)

图2 各组大鼠膈肌SERCA mRNA RT-PCR产物电泳凝胶

3 讨论

注射内毒素可引起大鼠全身功能的损伤，全身炎症的扩散，造成了各组织器官的严重损伤，致使细胞坏死〔7〕。膈肌易受炎症反应影响，内毒素可导致大鼠膈肌线粒体肿胀、变形，嵴减少，膈肌收缩力下降〔8〕，并选择性耗竭膈肌线粒体电子传递链中关键部位，降低离子泵和ATP的生成〔9〕。本实验表明，随着内毒素血症的时间发展，膈肌收缩和舒张功能明显下降，膈肌组织超微结构损伤严重，肌纤维肿胀，坏死溶解，横纹消失，线粒体数量减少，线粒体空泡化或囊泡化。

SERCA是肌浆网中含量最丰富的蛋白，是将 Ca2+转运并释放到细胞外的一种钙转运蛋白，从而引起并保持肌肉舒张。当其功能发生障碍时，细胞 Ca2+转运能力下降引起Ca2+平衡紊乱〔10〕。膈肌力学指标1/2RT反映肌浆网对Ca2+再摄取的速度;低频疲劳(即在＜25 Hz电刺激下肌力特别低)主要与肌浆网释放Ca2+减少，导致肌肉兴奋-收缩耦联障碍有关〔6〕。本实验结果提示内毒素可引起SERCA活性的降低，肌浆网钙摄取下降，膈肌细胞内Ca2+大量聚集，导致细胞内钙超载，并最终导致膈肌收缩、舒张功能障碍。

1 Orellana RA，O'connor PM，Nguyen HV，et al.Endotoxemia reduces skeletal muscle protein synthesis in neonates〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2002;283(5)：E909-16.

2 Orellana RA，O'connor PM，Bush JA，et al.Modulation of muscle protein synthesis by insulin is maintained during neonatal endotoxemia〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2006;291(1)：E159-66.

3 Liu SH，Lai JL，Yang RS，et al.Nitric oxide is not involved in the endotoxemia-induced alterations in Ca2+and ryanodine responses in mouse diaphragms〔J〕.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2002;366(4)：327-34.

4 Supinski GS，Vanags J，Callahan LA.Effect of proteasome inhibitors on endotoxin-induced diaphragm dysfunction〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009;296(6)：L994-L1001.

5 胡 杰，于 影，高 琴，等.阿霉素中毒大鼠膈肌骨架蛋白和肌浆网钙泵的表达变化及意义〔J〕.中国药理学通报，2010;26(2)：244-7.

6 徐旋里，杨秋火，谢强敏，等.咖啡因对低氧高碳酸性大鼠膈肌疲劳的影响〔J〕. 中国药理学通报，2005;21(3)：377-8.

7 孙晓霞，崔新明，王健春，等.人参二醇皂苷对感染性休克大鼠血清心肌酶和心肌超微结构的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(15)：2139-41.

8 焦光宇，毕 涛，高鸿美，等.内毒素对大鼠膈肌收缩功能及线粒体超微结构的影响〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2008;31(6)：431-5.

9 Callahan LA，Supinski GS.Sepsis induces diaphragm electron transport chain dysfunction and protein depletion〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2005;172(7)：861-8.

10 Fukui K，Kaneda M，Takahashi E，et al.Protective effects of sulfhydryl compounds on HOCl-induced intracellular Ca2+increase in single rat ventricular myocytes〔J〕.J Mol Cell Cardiol，1994;26(4)：455-61.

Dysfunction and changes of gene expression in sarcoplasmic reticulum calcium pump in endotoxin-induced diaphragm

FANG Ying-Yan，GUO Xiao-Lei，MA Li，et al.
Department of Physiology，Bengbu Medical College，Bengbu 233030，Anhui，China

Objective To investigate endotoxemia inducing the changes of diaphragm dysfunction and gene expression in sarcoplasmic reticulum calcium pump in rats.Methods Rats were given saline(0.5 ml ip，saline control group)and endotoxin(12 mg/kg ip，endotoxin group)respectively.Animals were killed at 24，48 and 96 hours after injections.Assessments were made of the diaphragm contractility，such as peak twitch tension(Pt)，maximum tetanic tension(Po)，time to peak contraction(CT)，half relaxation time(1/2RT)and diaphragm force-frequency relationships，and the change of the ultrastructures and the content of sarcoplasmic reticulum calcium pump(SERCA mRNA)was analyzed by reverse transcriptase polymerize chain reactive.Results Compared with control group，Pt and Po of endotoxin group were lower(P＜0.01)，CT and 1/2RT of endotoxin group were significantly longer(P＜0.01);Tetanic force under the stimulus frequency of 10，20，40，60，100 Hz in endotoxin group were decreased significantly(P ＜0.01).Transmission electron microscopic morphometry of diaphragm in endotoxin group revealed diaphragm myoneme confused and broken，sarcoplasmic reticulum was distended，the quantity of mitochondria was decreased，mitochondria edema and expanded，its cristae broken and vague，a great quantity of mitochondria vacuolization or vesiculation.The expression of SERCA mRNA in diaphragm was lower in endotoxin group than that of control group(P＜0.01).Conclusions Endotoxin destroys the diaphragmatic ultrastructure and induces diaphragmatic dysfunction，it could also decrease SERCA mRNA contents.

Endotoxin;Diaphragms;SERCA

R363.2

A

1005-9202(2012)23-5167-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.031

国家自然科学基金(No.81000074);安徽省教育厅自然科研基金项目(No.KJ2012Z250)

1 蚌埠医学院第二附属医院感染科

关宿东(1961-)，男，硕士生导师，教授，主要从事呼吸生理与病理生理学研究。

方迎艳(1977-)，女，硕士，讲师，主要从事呼吸生理与病理生理学研究。

〔2012-02-28收稿 2012-04-12修回〕

(编辑 曹梦园)