不同浓度吗啡对5-氟尿嘧啶诱导的MCF-7乳腺癌细胞凋亡时Bcl-2、Bax表达的影响

郝振军 王志学 孙立新 闫彩云 李汝泓 雷 燕 (承德市妇幼保健院麻醉科，河北 承德 067000)

不同浓度吗啡对5-氟尿嘧啶诱导的MCF-7乳腺癌细胞凋亡时Bcl-2、Bax表达的影响

郝振军 王志学1孙立新2闫彩云1李汝泓1雷 燕3(承德市妇幼保健院麻醉科，河北 承德 067000)

目的 研究吗啡与5-氟尿嘧啶(5-Fu)联合应用对MCF-7乳腺癌细胞Bcl-2、Bax表达的影响。方法 药物作用48 h后通过免疫细胞化学技术检测Bcl-2、Bax表达情况。结果 Bcl-2表达情况：未处理组最强。单独应用吗啡处理时，浓度为250、1 250 μmol/L引起Bcl-2表达减弱(P＜0.05，P＜0.01)，三种浓度的吗啡与5-Fu联合应用均具有协同作用(P＜0.05)。Bax表达情况：未处理组最弱。单独应用吗啡处理时，250、1 250 μmol/L浓度的吗啡引起Bax表达增强(P＜0.05，P＜0.01)，三种浓度的吗啡与5-Fu联合应用，均具有协同作用(P＜0.05)。结论 一定浓度的吗啡能与5-Fu发挥协同作用，强化5-Fu诱导的Bcl-2表达下调、Bax表达上调，且与吗啡的浓度有一定的剂量依赖关系。

吗啡;5-氟尿嘧啶;MCF-7;Bcl-2;Bax

长期以来阿片类药物广泛应用于癌痛治疗，吗啡的抑癌作用得以证实〔1〕，这无疑为阿片类药物用于癌症病人的疼痛治疗增加了信心。但由于癌症病人的疼痛治疗往往不是单独药物实施，常与癌症病人的化疗同时进行，吗啡与化疗药物联合应用对抗癌效果有何影响值得关注。Bcl-2家族是凋亡研究中最受重视的癌基因之一，Bcl-2/Bax比值对决定细胞是否进入凋亡状态有重要意义〔2〕。本研究拟探讨吗啡与5-氟尿嘧啶 (5-Fu)联合应用对乳腺癌细胞株MCF-7细胞Bcl-2、Bax表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MCF-7细胞，南京凯基生物科技发展有限公司;吗啡注射液，东北制药集团公司;5-Fu注射液，上海旭东海普药业有限公司;胎牛血清，天津血液学研究所;RPMI1640培养基，Gibcobrl公司;鼠抗人Bcl-2、Bax免疫组化单克隆抗体，福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 仪器与设备

YT-CJ-1N超净工作台，北京亚泰科隆实验科技开发中心;CO2电热恒温培养箱，日本SANYO公司;HWSY21-K4C电热恒温水浴箱，北京市长风仪器仪表公司;QL-901振荡器，中国其林贝尔;光学显微镜、倒置显微镜，日本Olympus;荧光倒置显微镜、数码摄像系统、显微采图系统，日本尼康;Mivnt显微图像分析系统，珠海微宇科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分组 共分8组，用含不同药物的RPMI1640完全培养液培养。U组为非药物处理组，F组为500 μmol/L 5-Fu处理组，LM组为50 μmol/L吗啡处理组，MM组为250 μmol/L吗啡处理组，HM组为1 250 μmol/L吗啡处理组，LM+F组为50 μmol/L吗啡与500 μmol/L 5-Fu联合处理组，MM+F组为250 μmol/L吗啡与500 μmol/L 5-Fu联合处理组，HM+F组为1 250 μmol/L吗啡与500 μmol/L 5-Fu联合处理组。

1.3.2 细胞培养 细胞复苏成功后，调整浓度为1×106/ml接种于培养瓶，静置于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱内，用RPMI1640完全培养液进行培养，隔日换液。待贴壁70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3.3 细胞免疫化学检测Bcl-2、Bax表达 将对数生长期的MCF-7细胞，制备成单细胞悬液，准确计数，调整细胞浓度约4×105/ml，接种在预先置于培养皿中的1 cm×1 cm盖玻片上，每片接种0.5 ml。细胞贴壁后，分别向培养皿中加入预先配置好的含不同药物的培养液，孵育48 h。丙酮固定、风干，磷酸盐缓冲液 (PBS)冲洗，过氧化氢孵育，PBS再冲洗，血清封闭。加一抗，4℃过夜，PBS冲洗。加二抗，室温下15～20 min，PBS冲洗。加二氨基联苯胺 (DAB)溶液，显微镜下观察3～5 min。苏木素复染，返蓝，经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。各组细胞药物作用48 h，染色后的载玻片用Nikon Eclipse 50i显微采图系统对Bcl-2、Bax免疫阳性物进行采图，MiVnt显微图像分析系统进行定量分析。每组测量5张片，每张片于200倍镜下随机选取5个不同视野成像，测其平均灰度，取其平均值代表一张片上的阳性细胞平均灰度 (AGL)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 免疫细胞化学染色检测Bcl-2蛋白表达情况

正常对照组可见绝大多数细胞质棕黄色染色，AGL最小、Bcl-2表达最强。单独应用吗啡处理时，随着吗啡浓度的增加，胞质棕黄色染色依次减弱、AGL依次增加;250、1 250 μmol/L浓度的吗啡引起MCF-7细胞Bcl-2表达减弱 (P＜0.05，P＜0.01)，但吗啡与Bcl-2表达的剂量依赖关系不明显。单独应用500 μmol/L 5-Fu处理时，胞质棕黄色染色减弱、AGL增加(P＜0.01)，引起MCF-7细胞Bcl-2表达减弱。与500 μmol/L 5-Fu联合应用，随着联合用药中吗啡浓度增加，胞质棕黄色染色依次减弱，AGL依次增加;三组吗啡与5-Fu联合应用均具有协同作用 (P＜0.05)，比单独应用500 μmol/L 5-Fu或该浓度吗啡更能引起MCF-7细胞Bcl-2表达减弱，但联合用药中吗啡与Bcl-2表达的剂量依赖关系不明显。见表1，图1。

2.2 免疫细胞化学染色检测Bax蛋白表达情况

见表1，图2。正常对照组可见绝大多数细胞质棕黄色染色不明显，AGL最大、Bax表达最弱。单独应用不同浓度的吗啡处理时，随着吗啡浓度的增加，胞质棕黄色染色依次增强，AGL依次降低;250、1 250 μmol/L浓度的吗啡引起MCF-7细胞Bax表达增强(P＜0.01)，且吗啡与Bax表达存在剂量依赖关系。单独应用500 μmol/L 5-Fu处理时，胞质棕黄色染色增强，AGL降低，引起MCF-7细胞 Bax表达增强 (P＜0.05)。与500 μmol/L 5-Fu联合应用，随着联合用药中吗啡浓度增加，胞质棕黄色染色依次增强，AGL依次降低;三组吗啡与5-Fu联合应用，均具有协同作用 (P＜0.05)，比单独应用500 μmol/L 5-Fu或该浓度吗啡更能引起MCF-7细胞Bax表达增强，但联合用药中吗啡与Bax表达的剂量依赖关系不明显。

图1 免疫细胞化学检测不同药物处理48 h各组MCF-7胞质内Bcl-2蛋白表达(×200)

图2 免疫细胞化学检测不同药物处理48 h各组MCF-7胞质内Bax蛋白表达(×200)

表1 免疫细胞化学检测不同药物处理48 h各组的Bcl-2、Bax蛋白表达± s，n=5)

表1 免疫细胞化学检测不同药物处理48 h各组的Bcl-2、Bax蛋白表达± s，n=5)

与U 组比较：1)P＜0.05，2)P＜0.01;与LM 组比较：3)P＜0.01;与 MM组比较：4)P＜0.01;与HM组比较：5)P＜0.01;与F组比较：6)P＜0.05

组别Bcl-2 AGL Bax AGL U组158.183±8.96 212.78±11.48 LM组 160.490±7.786 207.67±7.80 MM组 170.191±8.6131) 189.31±7.952)HM组 188.176±12.6052) 173.76±10.692)LM+F组 197.827±8.6012)3)6) 150.24±11.892)3)6)MM+F组 207.779±8.8812)4)6) 141.75±8.762)4)6)HM+F组 226.635±5.6762)5)6) 127.81±10.732)5)6)F组 178.491±9.4932) 176.78±7.882)

3 讨论

Bcl-2家族是凋亡研究中最受重视的癌基因之一，由抗凋亡基因和促凋亡基因组成，Bcl-2家族对细胞凋亡的调控取决于各成员间的相互作用。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族中最重要的两个成员，它们影响着线粒体膜的通透性。Bcl-2位于线粒体的内膜，可以稳定线粒体，通过抑制PT孔开放，保护线粒体完整性，从而抑制其内凋亡诱导因子Cyt C的释放〔3〕。Bcl-2亦可防止一些与凋亡有关的基因被激活或抑制这些基因表达产物的功能〔4〕。肿瘤细胞在Bcl-2的庇护下，可以逃避免疫系统的识别无限制生长，而且Bcl-2的高表达还给癌细胞提供了足够长时间来进行突变以增加复制和扩散能力，从而推动肿瘤细胞进一步发展。目前发现许多人类肿瘤均与Bcl-2的高表达有关，Alsabech等〔5〕检测了在371例乳腺癌中Bcl-2的表达情况，有高达79.3%的阳性率，而且染色普遍很强。Bax是Bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡蛋白，位于胞质，氧化应激反应时转位到线粒体外膜，影响线粒体通透性并且诱导Cyt C释放到胞质中〔3〕。Bax可自身形成同源二聚体或与Bcl-2形成异源二聚体，当细胞中Bcl-2较多时，Bcl-2/Bax异源二聚体增加，凋亡趋势减弱;当细胞中Bax较多时，Bax自身形成的同源二聚体占主导，则趋于凋亡。因此目前认为，Bcl-2的凋亡抑制作用能被Bax拮抗，Bcl-2/Bax比值对于细胞是否进入凋亡状态有重要的决定性意义〔2〕。吗啡作为疼痛治疗的一线药，同时有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。Singhal等〔6〕发现，吗啡对巨噬细胞的促凋亡是通过转移生长因子-β(TGF-β)的产生进而增加凋亡蛋白Bax而实现的。5-Fu可能通过上调Bax表达并改变Bax/Bcl-2比值而诱导凋亡，也早已被广泛证实。

本研究结果显示，5-Fu与吗啡联合应用在诱导肿瘤细胞凋亡过程中Bcl-2表达下调、Bax表达上调、Bcl-2/Bax比值降低更加显著，说明两药联合应用在线粒体途径促进细胞凋亡过程中能发挥协同作用，显著降低了MCF-7细胞对凋亡的抵抗性，提高了对凋亡诱导因素的敏感性〔7〕。

1 Tegeder I，Grosch S，Schmidtko A，et al.Protein-independent G1 cell cycle block and apoptosis with morphine in adenocarcinoma cells：involvement of p53 Phosphorylation〔J〕.Cancer Res，2003;63(8)：1846-52.

2 Simone F，Debatin KM.Apoptosis in drug response〔J〕.Curr Pharm，2003;1(1)：9-16.

3 Guo B，Zhai D，Cabezas E，et al.Humanin peptide suppresses apoptosis by interfering with Bax activation〔J〕.Nature，2003;423(6938)：456-61.

4 Oltvai Z，Milliman CL，Korsmever SJ，et al.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog，Bax，that accelerates programmed cell death〔J〕.Cell，1993;74(4)：609-12.

5 Alsabech R，Wilson CS，Ahn CW，et al.Expression of bcl-2 by breast cancer：a possible diagnostic application〔J〕.Mod Pathol，1996;9(4)：439-44.

6 Singhal PC，Kapasi AA，Franki N，et al.Morphine-induced macrophage apoptosis：the role of transforming growth factor-β〔J〕.Immunology，2000;100(1)：57-62.

7 Ashkenazi A，Dixit VM，Death receptors：signaling and modulation〔J〕.Science，1998;281(5381)：1305-7.

Effects of different concentrations of morphine on Bcl-2 and Bax expressions in the process of MCF-7 cellular apoptosis induced by 5-Fluorouracil

HAO Zhen-Jun，WANG Zhi-Xue，SUN Li-Xin，et al.
Department of Anesthesiology，Chengde Maternal and Child Health Hospital，Chengde 067000，Hebei，China

Objective To study on the effects of different concentrations of morphine on Bcl-2 and Bax expressions in the process of MCF-7 cellular apoptosis induced by 5-Fluorouracil.Methods After treated for 48 h，the expressions of Bcl-2 and Bax were detected by immunocytochemistry.Results The expression of Bcl-2 of untreated group was the strongest.Using 500 μmol/L 5-FU only，the expression of Bcl-2 was decreased(P ＜0.01).Using morphine only，250 and 1 250 μmol/L of morphine leaded to decreasing the expression of Bcl-2(P＜0.05，P＜0.01).Using morphine combined with 5-FU，the synergisms of morphine with 5-FU were found in all three groups(P ＜0.05).The expression of Bax in untreated group was the weakest.Using 500 μmol/L 5-FU only，the expression of Bax was increased(P ＜0.01).Using morphine only，250 and 1 250 μmol/L of morphine leaded to increasing the expression of Bax(P ＜0.05，P ＜0.01).Using morphine combined with 5-FU，the synergisms were found in all three groups(P＜0.05).Conclusions Morphine in certain concentration could enhance significantly the down-regulating effect on Bcl-2 expression and up-regulating effect on Bax expression that are induced in MCF-7 breast cancer cells，in certain dose dependent manner.Combination of morphine and 5-FU could show synergisms

Morphine;5-fluorouracil;MCF-7;Bcl-2;Bax

R73-36;R34

A

1005-9202(2012)23-5164-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.030

承德市科学技术研究与发展计划项目(No.201121037)

1 承德医学院附属医院麻醉科

2 承德医学院附属医院中心实验室

3 承德医学院附属医院手术室

王志学(1978-)，男，医学硕士，讲师，主治医师，主要从事癌痛治疗对肿瘤生物学行为影响方面的研究。

郝振军(1969-)，男，主治医师，主要从事麻醉药理学方面的研究。

〔2012-02-08收稿 2012-08-26修回〕

(编辑 袁左鸣)