高糖环境下脂联素对人心肌细胞增殖的影响

张俊洁 李兴

近年来，糖尿病心血管疾病已成为糖尿患者死亡主要原因之一，而未治疗的糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)能迅速发展为心功能衰竭，所以其发生及发展过程中心肌病变的研究渐为人们所重视。多项研究认为糖尿病患者高血糖通过蛋白激酶C机制，参与糖尿病并发症的发生、发展。脂联素(Adiponectin，ADPN)是近年研究的热点，许多研究显示脂联素在心衰和心室重构过程中起到重要作用［1，2］，具有心脏保护功能。但国内外关于脂联素对高糖环境中HCM增殖报道较少，本研究旨在探讨高糖环境下脂联素对HCM增殖的影响，以揭示脂联素对高糖环境下人心肌细胞的可能保护作用，从而为预防、治疗糖尿病心肌病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人心肌细胞购于北方伟业发展有限公司，DMEM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青)，D-2葡萄糖、MTT试剂盒(美国Sigma公司)，脂联素Human gAcrp(Pep rotech)，Trizol试剂(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.2 人心肌细胞的培养及分组 HCM培养于含10%胎牛血清、5.5 mmol/L D-葡萄糖、100U/ml链霉素的DMEM培养液，并置于含5%CO2的37°恒温培养箱中孵育，每3～4天用0.25%胰酶消化传代，待细胞生长成亚融合状态时。取部分细胞以1×104/ml接种于96孔细胞培养板，待细胞贴壁后，改用无血清DMEM培养液使细胞同步化生长24 h后，弃上清液，将其分为正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液)、高糖组(30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液)、脂联素组 (30.0 mmol/L+2.5 μg/mlADPN的DMEM培养液)，以备MTT用。剩余细胞换为无血清DMEM培养液使细胞同步化生长24 h后，将其分为正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液)、高糖组(30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液)、脂联素组 (30.0 mmol/L+2.5 μg/mlADPN的DMEM培养液)。

1.3 MTT法测HCM增殖 每组设4个复孔，同时设调零孔，进行培养，为排除营养成分消耗对试验结果产生误差于48 h更换培养液一次。培养24、48、72 h后进行MTT检测，每孔加入 5 mg/ml的 MTT20 μl，继续孵育 4 h，吸取上清，每孔加入二甲基亚枫(DMSO)150 μl，振荡 10 min，于酶标仪490nm处测吸光度(OD值)。

2 结果

在24 h高糖组与正常组比较人心肌细胞增殖有促进作用(P＜0.05)，而高糖组与脂联素组比较没有统计学差异(P＞0.05)。48、72 h高糖组与正常对照组比较细胞增殖受抑制(P＜0.05)。在加入脂联素后48、72 h脂联素组与高糖组比较细胞增殖增加，随时间的延长细胞增殖增加明显，有统计学差异(P＜0.01)。(见表1)

表1 脂联素对高糖环境下HCM增殖的影响(OD值)(±s)(n=3)

表1 脂联素对高糖环境下HCM增殖的影响(OD值)(±s)(n=3)

注:*P＜0.05;#P＜0.01

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3 讨论

糖尿病性心肌病是一种特异性的心肌病，是糖尿病的严重慢性并发症之一，其典型病理改变为心肌细胞肥大，心肌间质增生及纤维化、心肌局灶性坏死、心肌血管壁增厚等。Braunwald等［3］认为糖尿病心肌病的可能原因包括胶原和终末糖基化产物修饰的细胞外基质蛋白积聚，导致心肌的顺应性和舒张功能受损，心肌钙调控异常，蛋白激酶-C(PKC)的激活，心脏自主神经功能紊乱，基因突变等。病程早期以心脏舒张功能异常为主，后期收缩功能也受损，出现心力衰竭的临床表现。其中，心肌细胞功能受损是糖尿病心肌病发生、发展的关键。

本研究结果显示，高糖环境下心肌细胞的增殖受到抑制，可能是由于高糖通过葡萄糖依赖性通路选择性激活PKC，尤其是PKC-β1.从而引起细胞信号传导异常而引起细胞凋亡和纤维化。Min等［4］通过对NF-кB途径抑制检测新生大白鼠心肌细胞中 PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos表达，认为高血糖可以通过 PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos信号转导途径引起心肌细胞肥大。高糖还可激活p38MAKP，直接底物磷酸化AP-1、c-myc、c-jun 等，调节基因表达［5］，促进心肌细胞肥大。

ADPN是近年发现的一种由白色脂肪组织分泌的蛋白产物，由位于3q27的apM1基因编码，相对分子质量约3×104，具有244个氨基酸残基。正常情况下，ADPN的血浆浓度为5～30ug/ml，约占总血浆蛋白量的0.01%。其是一种具有对糖尿病保护作用的蛋白质，多项研究证明其具有抗炎、抗纤维化、抗动脉粥样硬化等多种作用。国外实验研究，Yajing［6］等对雄性小鼠心肌细胞经脂联素干预后也发现细胞死亡减少，起到对糖尿病心肌保护作用。对多种细胞研究显示［7］:在活体内ADPN下调Bcl-2基因的表达，同时也可能抑制NF-Kb以及上调VEGF的转录因子的激活。但目前对糖尿病心肌病研究较少，尤其脂联素对心肌细胞保护的机制尚不清楚，本实验结果示加入脂联素后阻断了高糖对心肌细胞的损害，HCM增殖能力增加，并呈时间依赖性，提示脂联素可能通过抗炎、抗纤维化作用直接或间接起到保护心肌细胞的作用，为临床应用脂联素治疗糖尿病心肌病提供了理论依据。

［1］Fujioka D，Kawabata K，Saito Y，et al.Role of adiponectin receptors in endothelin-induced hypertrophy in cultured cardiomyocytes and their expression infracted heart.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290:H2409-H2416.

［2］Liao Y，Takashima S，Maeda N，et al.Exacerbation of heart failure in adiponectin-deficient mice due to impaired regulation of AMPK and glucose metabolism.Cardiovasc Res，2005，67:705-713.

［3］Braunwald.Heart disease:A Textbook of Cardiovascular Medicine.6thed，2001:2133-2150.

［4］Min W，Bin ZW，Quin ZB，et al.The signal transduction pathway of PKC/NF-kappaB/c-fos may be involved in the influence of high glucose on the cardiomyocytes of neonatal rats.Cardiovasc Diabetol，2009，11:8-8.

［5］Way KJ，Isshiki K，Suzuma K，et al.Expression of connective tissue growth factor is increased ininjured myocardium associated with protein kinase C beta2 activation and diabetes.Diabetes，2002，51(9):2709-2718.

［6］Min W，Bin ZW，Quin ZB，et al.The signal transduction pathway of PKC/NF-kappaB/c-fos may be involved in the influence of high glucose on the cardiomyocytes of neonatal rats.Cardiovasc Diabetol，2009，11:8-8.

［7］Yajing W，Erhe G，Ling T，et al.AMP-activated protein kinase deficiency enhances myocardial ischemia/reperfusion injury but has minimal effect on the antioxidant/antinitrative protection of adiponectin.Circulation，2009，119:835-844.