肿瘤坏死因子－α增加肾入球动脉平滑肌细胞胞内钙离子浓度的机制

金旭鹏 郭莲怡 (辽宁医学院基础学院，辽宁 锦州 121000)

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是单核-巨噬细胞产生的具有多种生物活性的细胞因子，参与抗感染、发热、休克等多种病理生理过程〔1〕。TNF-α也是引起重症肝病发生发展的重要因子〔2〕。肝肾综合征(HRS)是继发于重症肝病的肾衰竭，多种因素参与其发病〔3〕。肾血管收缩引起的肾血流量锐减是HRS的主要发病因素。肾血流量受肾小球入球小动脉收缩和舒张的控制，而肾入球动脉平滑肌细胞(RASMCs)内Ca2+水平高低与肾入球动脉的舒缩功能直接相关。本研究观察TNF-α对RASMCs内钙离子浓度(〔Ca2+〕i)的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 200～250 g普通级雄性SD大鼠(由辽宁医学院实验动物中心提供)，许可证号：SCXK(辽2003-0007)，开放系统饲养，实验前禁食12 h。进行原代RASMCs的分离与培养。

1.2 主要试剂 Fluo-3/AM乙酰甲酯、TNF-α、2-氨基乙基二苯硼酸盐(2-APB)、内皮素(美国 Sigma公司)、PSS缓冲液(PSS：0.1 mmol CaCl2，125.0 mmol NaCl2，5.0 mmol KCl，1.0 mmol MgCl2，10.0 mmol Glucose，20.0 mmol HEPES)。

1.3 主要实验器材 CK30-12PHP相差显微镜，日本OLYMPUS;JEM-1200EX电镜，日本;激光共聚焦显微镜(Uitma212型)，Meridina公司;MetaFlour4.5软件，德国Carl Zeiss公司。

1.4 方法

1.4.1 参照文献〔4〕行大鼠RASMCs的分离与培养 戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，摘除肾脏，留取皮质，应用筛网和酶消化法分离RASMCs，最后加入完全营养液，并以1×104细胞数接种于25 cm2培养瓶内，于CO2孵箱中培养，前3 d每天换液，以后隔天换液，1 w后可行细胞传代。相差显微镜观察细胞生长情况，取3～10代细胞用于实验。

1.4.2 RASMCs电镜标本制备 培养瓶中细胞生长至单层融合后，加1 ml胰酶消化、吹打，将细胞收于1 ml EP管中，1 500 r/min 4℃ 离心 4 min，弃上清，小心加入 1 ml PBS，1 500 r/min 4℃离心4 min，弃上清，小心加入1 ml 2.5%戊二醛固定2 h，1%锇酸后固定1 h，常规丙酮脱水，经浸透、树脂包埋、超薄切片，醋酸铀染色，JEM-1200EX电镜观察。

1.4.3 实验分组 TNF-α处理(0 h，24 h)分2组：ET刺激组(A1)：实验中加入 ET(100 nmol/L)刺激，不加 TNF-α;TNF-α +ET 刺激组(A2)：实验前24 h 加入 TNF-α(100 μg/L)，实验中加入 ET(100 nmol/L)刺激。2-APB阻断分2组：2-APB+ET刺激组(B1)：加 ET前10 min加入2-APB，实验中加入ET(100 nmol/L)刺激;TNF-α+2-APB+ET刺激组(B2)：实验前24 h加入 TNF-α(100 μg/L)，加 ET前 10 min加入 2-APB(30 μmol/L)，实验中加入 ET(100 nmol/L)刺激。

1.4.4 细胞内钙离子浓度的测定〔5〕各组细胞均加入钙离子荧光探针Fluo-3/AM(5 μmol/L)，Fluo-3/AM可以和钙离子结合，产生较强的荧光，采用confocal显微镜测定单个活细胞内Ca2+荧光强度(发射波长505 nm，激发波长488 nm)。动态观察各组细胞胞内钙荧光强度(FI)的变化。采用LSM510软件对数据、图形进行实时动态测量与分析，根据给药前后单个细胞的FI值计算出细胞内〔Ca2+〕i。每组设2个平皿，并用不同代细胞重复3次。依据Grynkiewicz公式，计算〔Ca2+〕i。

1.5 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件分析，计量数据以s表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 RASMCs的鉴定 原代培养的RASMCs大小不等，形状多样，呈梭形或者三角形等形状;传代培养的RASMCs形态多呈梭形或者长梭形。透射电镜见细胞胞质内大量纵行束样分布的肌丝，上述结果表明所获细胞为RASMCs。见图1。

图1 RASMCs的生长情况

2.2 RASMCs内〔Ca2+〕i的测定 各组细胞加ET刺激前，即静息状态下〔Ca2+〕i无显著差异(P＞0.05)，亦未发生自主性上升，只是因指示剂的衰减，荧光强度略有递减的趋势。加ET刺激后，A1组RASMCs在短时间内(约1 min)钙离子浓度迅速、显著增加(即峰值升高相)，与加 ET前比较有显著差异(P＜0.01);A2组RASMCs内〔Ca2+〕i上升明显增强，与 A1组比较差异显著(P＜0.01)。B1及B2组RASMCs内〔Ca2+〕i无明显变化，与加ET前比较无显著差异(P＞0.05);与A1组加ET后比较差异显著(P＜0.01)。见表1。

表1 各组RASMCs内〔Ca2+〕i的变化( s，nmol/L)

表1 各组RASMCs内〔Ca2+〕i的变化( s，nmol/L)

与加ET前比较：1)P＜0.01;与A1组加ET后比较：2)P＜0.01

组别 加ET前(静息状态)加ET后A1 109.51±52.63 240.36±56.781)A2 128.07±78.56 375.45±60.392)B1 112.69±57.76 101.66±48.032)B2 126.61±83.92 116.35±53.482)

3 讨论

HRS是重型肝炎和严重肝病最常见的并发症〔6〕。肾入球动脉平滑肌的舒缩对于肾皮质血流量的调节具有直接作用。本研究探讨TNF-α对RASMCs收缩及胞内Ca2+的影响。应用酶消化及筛网技术提取RASMCs，并进行原代培养，通过透射电镜观察胞质内的肌丝证实已成功分离培养RASMCs。

当HRS发生时，患者血清中内皮素等多种缩血管活性物质水平明显增高，并可直接或通过间接途径引起肾血管收缩，是导致肾血流灌注和肾功能紊乱的重要介质。血管平滑肌的舒缩直接受细胞内Ca2+水平的影响〔7〕，高浓度Ca2+可引起细胞收缩，低浓度Ca2+可引起细胞舒张，因此监测细胞内〔Ca2+〕i变化能反映细胞的舒缩状态。最近的实验研究发现，许多细胞因子可以使细胞内Ca2+水平增高，使效应细胞发生生物反应〔8〕。本实验结果说明 TNF-α可使内皮素刺激后的胞内〔Ca2+〕i增高。

1，4，5-三磷酸肌醇受体(IP3R)是平滑肌细胞内主要的Ca2+释放通道，当某些缩血管活性物质作用于细胞膜上的相应受体后，细胞内出现高水平的IP3，增高的IP3与IP3R结合，导致细胞内储备Ca2+释放，结果使效应细胞发生生物反应〔9〕。当HRS发生时，许多缩血管活性物质(如内皮素、血管紧张素Ⅱ、血管加压素、血栓素A2、白三烯等)明显增高〔10〕，作用于平滑肌细胞，引起胞内IP3水平增高，而致肾血管收缩。本研究结果显示，TNF-α增强内皮素刺激引起胞内Ca2+释放的作用可被2-APB阻断。故认为TNF-α间接影响胞内〔Ca2+〕i，是通过IP3R来起作用的。综上所述，内皮素刺激可使RASMCs在短时间内胞内〔Ca2+〕i迅速、显著增加。TNF-α作用后上述效应明显增强，且此效应可被2-APB阻断，证明了TNF-α可增强内皮素刺激引起的胞内钙离子释放进而增强细胞收缩，引起肾小球入球小动脉收缩，肾血流量减少，肾小球滤过率降低，参与HRS发生。上述研究不仅证明内皮素是通过激动IP3R而产生效应的;也证明了TNF-α可增强内皮素刺激引起的胞内Ca2+释放，且这一作用也是通过IP3R来调节的。

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