老年宫颈鳞癌患者HPV16/18感染与组织蛋白酶-D和血管内皮生长因子的关系

林芳惠 吴丹梅 (海口市计划生育服务站妇产科，海南 海口 570208)

宫颈鳞癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，其发生与发展是多因素综合作用的结果。研究表明，人乳头瘤状病毒(HPV)是宫颈鳞癌的主要危险因素，且老年人发病率逐年增高〔1〕。组织蛋白酶-D是一种蛋白水解酶，其表达可能与肿瘤预后有关〔2〕。血管内皮生长因子(VEGF)是重要的血管生长促进因子，在肿瘤中表达升高〔3〕。组织蛋白酶-D和VEGF可能在肿瘤中具有一定协同作用〔4〕。本实验探讨老年宫颈鳞癌组织中HPV16/18感染与组织蛋白酶-D和VEGF表达的关系，以期为研究肿瘤生物学行为及其防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 我院宫颈鳞癌老年患者术后预留的新鲜组织85例，并立即置于－80℃冰箱中冻存备用。观察组年龄60～78(平均67.1)岁。癌组织均符合WHO宫颈鳞癌诊断标准。排除：①术前进行放、化疗;②临床资料不完整;③合并其他内脏器官严重疾病。老年人子宫切除术(非肿瘤病变)后慢性宫颈炎组织新鲜标本60例为对照组，年龄60～77(平均67.4)岁。两组一般临床特征无明显差别，具有可比性。

1.2 方法 HPV16/18原位杂交检测试剂盒和生物素标记的HPV16/18探针购自福建泰普生物科学有限公司。原位杂交具体步骤：切片脱蜡水化;加蛋白酶K，37℃孵育18 min，梯度酒精脱水，每张切片加入10 μl生物素化探针，加盖玻片，95℃变性10 min，取出后迅速冷却，37℃下温箱中杂交3 h，去掉盖玻片;加SP-AP结合物，37℃孵育30 min，加BCIP/NBT室温显色5～15 min，核固红复染，中性树胶封片。组织蛋白酶-D和VEGF检测试剂盒均购自北京中杉金桥公司，流式细胞术检测参考刘爱东等〔2，5〕方法制备单细胞悬液(1 × 106ml－1)后，抽取1 ml，分别加入组织蛋白酶-D和VEGF稀释液，在室温中孵育30 min，加入PBS 10 ml洗涤后，弃去上清液，加入FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室温孵育30 min后，加入PBS 10 ml离心同上，弃上清除去未结合的荧光二抗。加入PBS 0.1 ml，经铜网过滤后上机检测。采用美国FACS420流式细胞仪进行检测。

1.3 结果判定标准 应用荧光指数(FI)表示结果，

1.4 统计学方法 应用SAS统计软件进行t和χ2检验。

2 结果

2.1 观察组与对照组HPV16/18阳性率比较 观察组HPV16/18表达阳性率〔60(70.59%)〕明显高于对照组〔6(10.00%)〕(χ2=52.064 7，P ＜0.000 1)。

2.2 两组组织蛋白酶-D和VEGF蛋白表达量比较 观察组组织蛋白酶-D(1.48±0.36)和 VEGF蛋白表达量(1.43±0.31)明显高于对照组(1.00±0.13)、(1.00±0.26)(t=11.63，P=0.001 2;t=10.31，P=0.004 6)。

2.3 宫颈鳞癌组织中HPV16/18、组织蛋白酶-D和VEGF表达的关系 HPV16/18阳性组中组织蛋白酶-D(1.59±0.16)和VEGF蛋白的表达量(1.52±0.24)明显高于HPV16/18阴性组(1.12 ±0.12、1.19 ± 0.21)(t=10.34，P=0.007 5;t=8.91，P=0.010 2)。

3 讨论

HPV是一种DNA病毒，属于乳头多泡病毒家族，约8 000碱基对构成，在DNA的结构上包括L1-E7和LCR一共9个基因组，其编码相对应的基因产物。依据其致癌作用的程度分为低危型、高危型和可能致癌型，其中高危型HPV16/18不仅在年轻人宫颈癌中增多，而且在老年宫颈鳞癌组织和细胞中检出率也明显增高〔6，7〕。宫颈鳞癌生长和扩散是重要的生物学行为，血管生成在宫颈鳞癌发生发展中起重要作用，也是影响宫颈鳞癌患者术后生存的关键因素。VEGF是目前研究最多的促血管生成因子，对肿瘤基质血管形成及肿瘤生物学行均有重要影响，尤其对肿瘤发展时的血管新生有明显促进作用〔8，9〕。组织蛋白酶-D是一种相对分子量为34 kD的门冬氨酸内蛋白酶，能溶解基底膜、细胞外基质(ECM)和结缔组织，促进肿瘤脉管生成，并刺激癌细胞生长。也有观点认为组织蛋白酶-D存在于所有细胞中，一方面可通过水解作用降解ECM，参与肿瘤侵袭和转移，另一方面，可以激活组织蛋白酶B，再次激活尿激酶激活因子，并与其受体结合，调节与肿瘤有关的蛋白分解作用〔10〕。

本实验结果提示HPV16/18、组织蛋白酶-D和VEGF在宫颈鳞癌发生发展中起重要作用，HPV16/18与组织蛋白酶-D和VEGF可能具有协同作用，组织蛋白酶-D可能作为上游蛋白，促进VEGF高表达，进而促进肿瘤血管生成，对宫颈鳞癌进展有重要的促进作用。HPV16/18可能对组织蛋白酶-D表达水平的调节有直接或间接影响，同时组织蛋白酶-D也可通过对凋亡细胞的调节参与HPV介导的对鳞状上皮细胞正常分化的调节障碍，其机制可能与HPV16/18编码的基因表达产物，特别是HPVE6、E7或E2蛋白有直接或间接影响。也有观点认为肿瘤侵袭和转移时，瘤细胞自脱离原瘤灶到转移灶的过程中，至少应穿越两次血管壁并向周围组织侵袭，而此过程中，组织蛋白酶-D能对基质金属蛋白酶进行有效调节，并对ECM有明显降解作用〔11〕，而且作用过程中，也对肿瘤血管生成起明显调节作用。HPV16/18对组织蛋白酶-D和VEGF的调节作用尚不完全清楚，需深入研究阐明。综上，高危型HPV16/18感染是老年宫颈鳞癌发生的主要原因，HPV16/18感染导致组织蛋白酶-D和VEGF蛋白表达增高，在老年人宫颈鳞癌发生、发展起重要作用。

1 严丽华，吴向坤，杜 峰，等.老年宫颈癌50例临床及预后分析〔J〕.现代生物医学进展，2011;11(15)：2928-30.

2 Wozniak B，Mila-Kierzenkowska C，Wozniak A，et al.The effect of combined therapy on activity of cathepsin D and alpha-1-antitrypsin in the blood serum of women with cervical cancer〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2008;29(6)：617-9.

3 刘爱东.流式细胞术检测胃癌中血管内皮生长因子的表达及意义〔J〕. 中国中医药资讯，2011;3(5)：219.

4 韩瑞珠，李 鹏，李晓丹.E-钙黏蛋白和组织蛋白酶-D与血管内皮生长因子在喉鳞癌转移中的作用〔J〕.中国耳鼻咽喉头颈外科，2005;12(2)：77-80.

5 刘爱东，刘士生，许志萍，等.E-cadherin在胃癌中的表达及意义〔J〕.广东医学，2007;28(11)：1806-7.

6 Huang Q，Qu QX，Xie F，et al.CD40 is overexpressed by HPV16/18-E6 positive cervical carcinoma and correlated with clinical parameters and vascular density〔J〕.Cancer Epidemiol，2011;35(4)：388-92.

7 郑曙民，陈 星，周秀英，等.宫颈鳞癌与HPV16和18及VEGF和TGF-β1 关系的探讨〔J〕. 肿瘤防治杂志，2004;11(6)：573-5.

8 Kuemmel S，Thomas A，Landt S，et al.Circulating vascular endothelial growth factors and their soluble receptors in pre-invasive，invasive and recurrent cervical cancer〔J〕.Anticancer Res，2009;29(2)：641-5.

9 刘爱东，庞久玲，刘士生.胃癌中基质金属蛋白酶-9和CD105表达关系的研究〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(7)：886-7.

10 Masson O，Prébois C，Derocq D，et al.Cathepsin-D，a key protease in breast cancer，is up-regulated in obese mouse and human adipose tissue，and controls adipogenesis〔J〕.PLoS One，2011;6(2)：e16452.

11 乌拉木，余科达，沈镇宙，等.组织蛋白酶D在乳腺导管内癌及伴早期浸润中的表达及其与复发转移的关系〔J〕.中国癌症杂志，2010;20(4)：247-50.