锌指蛋白185通过与肌动蛋白纤维结合抑制肿瘤细胞增殖

郑全辉 陆 斌 葛淑芝 张爱红 (河北联合大学基础医学院，河北 唐山 063000)

锌指蛋白(ZNF)185是一种c端含有LIM结构域的蛋白，由于mRNA的选择性剪切和转录/翻译起始位点的差异，ZNF185编码多个不同的蛋白剪切体。ZNF185在人体多种组织表达，尤以骨髓和前列腺表达最高〔1〕。近年来研究发现，ZNF185基因参与肌动蛋白(actin)共定位，并在肿瘤组织中表达下调〔2，3〕。本课题组前期发现在前列腺癌细胞中，ZNF185的表达显著降低，然而，对于ZNF185不同蛋白剪切体在前列腺癌细胞增殖中的作用少见报道。本文拟观察ZNF185不同蛋白剪切体与actin结合，并检测ZNF185不同蛋白剪切体对前列腺癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常前列腺组织取自唐山工人医院，人前列腺癌细胞系DU145、LNCaP、PWPE2由本实验室冻存。TRIzol试剂盒、Lipofactamine2000购自Invitrogen公司;各种限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶和反转录试剂盒购自TaKaRa公司;质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自 Axygen公司;兔抗人ZNF185一抗、兔抗人actin一抗和pEGFPC2绿色荧光蛋白表达质粒由中科院动物所赵勇研究员提供;HRP羊抗兔二抗和Phalloidin-TRITC(罗丹明标记的鬼笔环肽)购自北京博奥森公司;蛋白提取试剂盒和Bio-Rad蛋白浓度测定试剂盒购自北京天恩泽公司，引物由上海生物工程服务公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Western印迹 提取组织或细胞总蛋白，测定蛋白浓度。各取10 μg进行SDS-PAGE胶电泳。电泳后将蛋白电转(4℃，恒流300 mA，2 h)到硝酸纤维素膜(NC)上，然后将NC膜在含100 g/L脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h，加兔抗人ZNF185一抗(1∶1 000)4℃过夜，TBST洗去未结合的一抗，再加HRP羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室温作用1 h，TBST冲洗后加底物反应3 min，暗室曝光。

1.2.2 ZNF185 CDNA克隆 正常前列腺组织总RNA提取和反转录按照试剂盒说明书进行。PCR采用Pfx高保真DNA聚合酶和下列引物：上游：5'-GGAATTCATGAGTATCTCAGCTCTTG-3'，下 游：5'-ACGCGTCGACTAGAAGAGCTTCTCATAGC-3'。上、下游引物分别加入EcoR I/Sal I酶切位点。反应条件：94℃2 min，然后 94℃30 s，58℃45 s，72℃延伸 1 min;30 个循环，最后72℃孵育10 min，PCR产物胶回收并纯化。EcoR I/Sal I双酶切PCR产物和pEGFPC2质粒，回收纯化酶切产物，并利用T4 DNA连接酶将其连接在一起。转化，挑克隆进行序列测定。

1.2.3 细胞培养和转染 人前列腺癌细胞系DU145采用RPMI-1640培养基，5%胎牛血清常规培养。质粒转染采用Lipofactamine2000，按操作说明进行。为获得稳定转染ZNF185不同蛋白剪切体的细胞，DU145在转染24 h后，1∶2分离培养过夜，加入G418(600 mg/ml)筛选抗性克隆。选择培养2个月后，采用流式细胞仪分选绿色荧光蛋白阳性细胞，常规培养。

1.2.4 免疫荧光染色 在涂布纤维黏连蛋白(10 mg/ml)的玻片上培养ZNF185不同蛋白剪切体转染细胞，PBS冲洗，4%多聚甲醛中固定20 min，然后用0.1%Triton X-100/PBS透膜5 min。采用Phalloidin-TRITC(1∶40)标记actin纤维。LSM510激光共聚焦显微镜观察ZNF185蛋白剪切体与actin纤维的共定位。

1.2.5 细胞增殖检测 分别取 ZNF185(689aa)、ZNF185(452aa)和pEGFP2载体稳定转染细胞接种96孔板(2×104/孔)，每个样品3个复孔。每隔24 h收取细胞，台盘蓝染色计数，计算均数和标准差。连续计数6 d，绘制增殖曲线。

2 结果

2.1 ZNF185在前列腺癌细胞中表达显著降低 Western印迹检测人正常前列腺组织和不同前列腺癌细胞 LNCaP，DU145，PWPE2中ZNF185的表达，发现ZNF185在正常前列腺组织高表达，而在检测的前列腺癌细胞中，ZNF185的表达显著降低。见图1。

2.2 ZNF185蛋白剪切体克隆 从正常前列腺组织提取RNA，反转录扩增，扩增产物克隆至pEGFPC2载体，测序分析表明，克隆 cDNA主要编码两种多肽：一种为689aa多肽，包含ZNF185全长编码序列，其羧基端含有两个锌指结构(zinc-finger motif)组成的LIM结构域，氨基端为actin骨架结合结构域(ATD);另一种为452aa的多肽，除不含氨基端ATD结构域外，其他序列与全长ZNF185编码序列相同。见图2。

2.3 全长ZNF185结合actin纤维 分别将编码689aa和452aa的ZNF185-pEGFPC2质粒转染前列腺癌细胞系DU145，采用激光共聚焦显微镜观察不同ZNF185蛋白剪切体的细胞定位和与actin纤维的结合。ZNF185-EGFPC2编码蛋白由于带有绿色荧光蛋白(GFP)显绿色，actin荧光抗体受激发显红色。从图3可以看出，全长ZNF185蛋白主要分布在细胞质，并与actin纤维染色完全重合，而编码452aa的ZNF185蛋白在细胞核和细胞质均有分布，但由于缺乏ATD结构域不与actin纤维结合。

图1 Western印迹检测ZNF185的表达

图2 ZNF185蛋白剪切体克隆

图3 激光共聚焦显微镜检测452aa和689aa ZNF185与细胞actin骨架共定位

2.4 全长ZNF185抑制前列腺癌细胞的增殖 与正常前列腺组织相比，ZNF185在前列腺癌细胞中表达显著降低，提示ZNF185可能调控前列腺癌细胞的增殖。为此，本文分别将689aa和452aa的ZNF185-pEGFPC2质粒转染DU145，经G418筛选后获得稳定转染细胞株，Western印迹检测所得DU145细胞分别高表达全长ZNF185(689aa)和N端缺失ATD结构域的ZNF185(452aa)(图 4A)。分别将空载体，689aa和 452aa ZNF185-pEGFPC2稳定转染的DU145细胞接种96孔板，结果显示，表达ZNF185全长序列689aa的DU145与转染空载体pEGFPC2的对照组细胞相比，细胞增殖速率显著减低;而转染编码452aa ZNF185质粒的DU145细胞，增殖速率与对照组相比没有差异(图4B)。

图4 全长ZNF185抑制DU145细胞增殖

3 讨论

LIM蛋白是一类进化保守的蛋白家族，因其序列中包含LIM(Lin-1，Isl-1，Mec-3)结构域而得名。ZNF185蛋白属于第三组LIM结构域蛋白，首先由Heiss等通过定位克隆的方法得到，其基因定位于X染色体长臂2区8带(Xq28)DXS52区域。基于表达序列标签(EST)和基因组序列分析，ZNF185 cDNA编码一个452aa的蛋白，在其 C端有一个 LIM结构域，并推测ZNF185可能与细胞增殖和分化有关〔1〕。

2006年，Zhang等〔4〕从正常人前列腺癌组织中通过克隆测序，得到ZNF185全长cDNA。ZNF185全长cDNA编码蛋白比Heiss等克隆到的ZNF185分子在N端长出135个氨基酸，而且这段长出来的序列可以与actin相结合，被定义为ATD结构域。同时该研究也发现ZNF185编码基因包含24个外显子，由于不同外显子剪切，ZNF185基因至少编码4个不同氨基酸序列的蛋白产物，分别为：721aa、689aa、660aa 和 452aa，Heiss等公布的序列只是其中之一。721aa、689aa、660aa ZNF185包含多个蛋白-蛋白相互作用结构域，如：PDZ(Postsynaptic density-95，Discs large，zonaoccludens-1)、LD(Leucine-aspartate repeat)和 ATD 结构域;而452aa ZNF185缺少ATD结构域，提示可能与其他ZNF185蛋白剪切体存在功能差异。

ZNF185在人多种组织表达，前列腺组织表达最高，骨髓、外周血、甲状腺、脑、肾等组织也有较高表达，而在前列腺癌细胞中，ZNF185表达显著降低，这与Vanaja等〔5〕的结果一致。然而，ZNF185表达多个不同的蛋白剪切体，它们在前列腺细胞中的功能差异目前尚无报道。因此，我们克隆了689aa和452aa的ZNF185编码序列。荧光共定位研究显示只有689aa ZNF185与细胞actin骨架结合，与这两个ZNF185蛋白剪切体的结构域差异相符。有意思的是，452aa ZNF185不能抑制前列腺癌细胞的增殖，而只有包含ATD结构域的689aa ZNF185能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖。此结果表明，ZNF18与细胞actin骨架的结合是其发挥抑癌作用的关键。目前，细胞蛋白骨架成分表达和功能改变与肿瘤发生和发展的关系是肿瘤研究的一个亮点〔6〕，本研究结果为此领域的研究提供了新的线索。值得注意的是，452aa ZNF185在前列腺癌细胞中的表达也显著降低。因此，此蛋白剪切体在正常前列腺细胞中的功能尚需进一步探讨。

1 Heiss NS，Gloeckner G，Bachner D，et al.Genomic structure of a novel LIM domain gene(ZNF185)in Xq28 and comparisons with the orthologous murine transcript〔J〕.Genomics，1997;43(3)：329-38.

2 Rabbitts TH，Boehm T.LIM domains〔J〕.Nature，1990;346(6283)：418.

3 Sanchez-Garcia I，Rabbitts T.The LIM domains：a new structural motif found in zinc-finger-like protein〔J〕.Trends Genet，1994;10(9)：315-20.

4 Zhang JS，Gong A，Young CY.ZNF185，an actin-cytoskeleton-associated growth inhibitory LIM protein in prostate cancer〔J〕.Oncogene，2007;26(1)：111-22.

5 Vanaja DK，Cheville JC，Iturria SJ，et al.Transcriptional silencing of zinc finger protein 185 identified by expression profiling is associated with prostate cancer progression〔J〕.Cancer Res，2003;63(14)：3877-82.

6 Yamaguchi H，Condeelis J.Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion〔J〕.Biochim Biophys Acta，2007;1773(5)：642-52.