自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死后遗症30例

詹三华 张鲁峰 姚卫民 宋晓玲 刘林源 (武警河南省总队医院普内科，河南 郑州 450052)

脑梗死后遗症是脑血管疾病引起的一种顽固性疾病，对脑梗死后遗症的病人，临床治疗应用中药治疗、针灸、理疗等，疗效甚微。随着干细胞临床应用技术的研究，通过干细胞移植治疗脑梗死后遗症，给脑梗死的治疗带来了突破性进展。本文重点研究自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)经腰穿移植治疗脑梗死后遗症的疗效和安全性。

1 对象与方法

1.1 临床资料 2010～2011年我院30例脑梗死后遗症患者武警河南省总队医院普内科，年龄42～78岁，平均59岁;病程1.5～10.5年，平均4.5年。上述患者均经过头颅CT和磁共振检查确诊。

1.2 术前准备 术前8 h禁食，4 h禁水，移植当日对患者进行隔离，骨髓穿刺术前5 h进行房间消毒。

1.3 骨髓采集 在无菌条件下，局部麻醉消毒，取髂后上棘为穿刺点，以30号骨髓穿刺针穿刺，抽骨髓140～190 ml，肝素抗凝。

1.4 BMSCs分离和培养 分离骨髓单个核细胞步骤如下：(1)用无菌接口机将采集骨髓采血袋和一个50 ml一次性无菌塑料血袋相连。(2)离心，2 400 r/min，5 min，将血浆转移至50 ml一次性无菌塑料血袋内。(3)加入无菌PBS至红细胞悬液内等倍稀释。(4)将淋巴细胞分离液转移至四联袋主袋内。(5)等比例将稀释的骨髓血缓缓加入盛有淋巴细胞分离液的主袋内，以1 900 r/min，离心20 min。(6)主袋内液体自上而下分为5层，白膜层转移到另一成品袋内，此袋即为富集骨髓单个核细胞。(7)以2 500 r/min、离心5 min，生理盐水重复洗涤2次。经上述步骤分离出骨髓单个核细胞，将细胞加入体积比DME∶F12为1∶1的DMEM/F12培养基装于75 ml培养瓶中，置于37℃，饱和湿度体积分数为0.05的CO2培养箱内，细胞培养4 d，收集细胞，用生理盐水悬浮4 ml，进行BMSCs移植术。分离的骨髓单个核细胞呈悬浮样、小圆形，4 d后胞质丰富，核大且核仁明显，克隆团样生长，细胞数量明显增多(图1)。

1.5 移植方法 经腰穿注射至蛛网膜下腔(移植前，患者及家属签署治疗同意书，该研究经医院伦理委员会同意批准)。

1.6 疗效标准 痊愈：生活自理或正常工作，运动恢复正常，肢体感觉及语言恢复正常，1年随访未复发;显效：生活基本自理，运动、肢体感觉基本恢复，语言无障碍，1年随访未复发;好转：生活部分自理，活动、肢体感觉有所改善，语言一定恢复，1年随访较稳定;无效：生活仍不能自理，治疗前后症状无改善。

1.7 结果 总有效率86.7%，其中生活基本自理，体征和症状明显改善11例，为显效;生活部分自理，症状和体征有所改善15例，为好转;4例体征和症状无变化，为无效。未见不良反应及并发症发生。

图1 BMSCs培养4 d(×200)

2 讨论

脑梗死是导致成人残疾第一位疾病，也是第三位导致人类死亡的疾病，仅次于心血管疾病和恶性肿瘤。我国每年发生脑梗死的病人在100万人以上，其中约1/3的人失去劳动能力。脑梗死后遗症使患者肢体残疾，智力、语言障碍，成为严重的医学难题和社会问题。脑梗死后遗症的治疗取决于两个因素，第一、充分的发挥中枢系统的结构重构和功能重组，也就是中枢神经系统的可塑性;第二、梗死脑组织的吸收，侧支循环的建立，血管再通。在一定条件下BMSCS能够进行增殖，具有自我更新和多分化潜能，替代受损的神经细胞，达到治疗脑梗死后遗症的目的。

动物实验表明，BMSCs大部分移行至缺血皮质边缘〔1〕，而缺血对侧相应部位BMSCs相对减少。侧脑室中局部注射BMSCs，能够迁移至缺血部位分化为神经元。BMSCs增加神经细胞的数量，能改善神经功能状况，从而使脑梗死后遗症得到改善。通过脑脊液移植有二种方法，第一、在CT定位下做第四脑室或侧脑室穿刺注入的方法;第二、腰穿注射蛛网膜下腔。两种方法在双侧大脑半球均发现干细胞踪迹，BMSCs通过脑脊液的流动迁移到缺血损伤部位，使认知功能、语言功能，肢体运动功能明显改善。BMSCs是治疗脑梗死后遗症的理想种子细胞，替代中枢神经系统疾病功能受损的神经元，促进神经功能恢复。用BMSCs治疗脑梗死，生长因子、细胞因子增加和脑胶质细胞活化与神经功能的恢复相关〔1，2〕。BMSCs促进神经元的功能恢复和新的血管生成，同时血管内皮细胞促进神经干细胞增殖。BMSCs来自中胚层，主要存在于器官间质和全身结缔组织，其中骨髓组织中含量最多，具有多向分化能力，可以分化为骨、肌肉、软骨、神经等组织细胞〔3，4〕。BMSCs 扩增能力强免疫原性低，而且取材方便，具有多向分化潜能，合成细胞外基质，包括Ⅳ型胶原蛋白、白细胞介素(IL)-8、干细胞因子、集落刺激因子、神经营养因子、IL-11及造血调节分子等。IL-11对造血细胞和非造血细胞有多种作用，在中枢神经系统，其分布于齿状回颗粒细胞层、海马锥体细胞层、脊髓前角和侧角神经元。BMSCs通过分泌各种细胞因子促进神经组织功能改善和神经系统自我修复〔5，6〕。

1 翁金森，刘 楠，杜厚伟，等.骨髓间充质干细胞移植对脑梗塞大鼠神经功能恢复及突触素表达的影响〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2008;24(1)：34-7.

2 Yu X，Chen D，Zhang Y，et al.Overexpression of CXCR4 in mesenchymal stem cells promotes migration，neuroprotection and angiogenesis in a rat model of stroke〔J〕.J Neurol Sci，2012;316(1-2)：141-9.

3 Xu H，Miki K，Ishibashi S，et al.Transplantation of neuronal cells induced from human mesenchymal stem cells improves neurological functions after stroke without cell fusion〔J〕.J Neurosci Res，2010;88(16)：3598-609.

4 Komatsu K，Honmou O，Suzuki J，et al.Therapeutic time window of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after cerebral ischemia〔J〕.Brain Res，2010;1334：84-92.

5 Toyama K，Honmou O，Harada K，et al.Therapeutic benefits of angiogenetic gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischemia〔J〕.Exp Neurol，2009;216(1)：47-55.

6 Ikehara S.Bone marrow transplantation：a new strategy for intractable diseases〔J〕.Drugs Today(Barc)，2002;38(2)：103-11.