EB病毒转染冻存全血建立新疆和田长寿老人永生细胞株

吐尔洪·克维尔 袁晓华 穆斯塔帕 乔艳辉 左宏莉 (乌鲁木齐市血液中心，新疆 乌鲁木齐 830000)

EB病毒转化外周血 B淋巴细胞，使其成为一种能连续分裂永久生存的类淋巴母细胞，可作为生物标本库建立的首选方法，使具有特定生物学性状的标本得以长期保存，以便进行深入研究。近年来关于新疆和田老人长寿分子机制的研究已经取得一定进展〔1，2〕，更加深入的研究需要对长寿人群及对照组的遗传物质进行深入的比对分析，来源稳定和充足的研究样本是必要条件，而长寿老人的血液样本属于不可再生的珍贵资源，建立永生细胞株可以很好地解决。目前国内能利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞成功建立永生细胞系的实验室并不多，文献报道的各自转化方法和转化成功率不尽相同，对成功率的影响因素众多。现有的转化方法主要有四种，均可成功建系，一般按建系效率从高到低依次为：环孢霉素A法、冻存白细胞法、冻存全血法和微量全血法〔3，4〕。在血量充足、实验室可就近尽快实现转化的情况下，可选择环孢霉素A法。由于新疆地域辽阔，采样点遥远分散，采用冻存全血法进行永生细胞转化具有操作简单、所需标本量少及无需环孢霉素A的优点，便于远距离分散采血、集中转化。但该方法存在转化效率低、转化周期长的缺点。有报道长寿老人淋巴细胞的在采用环孢霉素A 法时，转化效率相对青壮年要低〔5，6〕，仅为 66.67%(24/36)，而后者成功率可达95%以上，目前还没有将冻存全血法用于长寿老人淋巴细胞转化的报道，为了提高冻存全血法的转化效率，本研究从避免冷冻损伤、减少红细胞干扰角度出发，对该方法进行改进。

1 材料与方法

1.1 试剂 RPMI1640(GIBCO)，FBS(Hyclone)，EB病毒株(B95-8，购自中科院上海细胞库)，淋巴细胞分离液 Ficol1(天津川贝)，DNA提取试剂盒(美国TE)，HLA分型检测，SSO荧光微珠流式分型试剂(LABType SSO，One Lambda)。

1.2 仪器 超净工作台，CO2恒温培养箱，－80℃超低温冰箱，24孔细胞培养板(CORNING)，25 cm2一次性培养瓶(CORNING)，冻存管(CORNING)，离心机，液氮罐，荧光微珠流式分析(Luminex)，HLATools结果判读分析软件(One Lambda)。

1.3 方法

1.3.1 采样 长寿老人年龄界定按5步法确认，具体方法参照文献〔2，3〕，采样在知情同意的原则下进行，并签署知情同意书，对采样对象采集5 ml肝素抗凝血用于转化和2 ml EDTA抗凝血用于提取DNA，常温下48 h内送回实验室。每份血样的转化采取环孢霉素A和冻存全血法双线进行，分别采取两种方法冻存至液氮，1 w以上后再以冻存全血法复苏转化。

1.3.2 EB病毒上清的制备EB病毒株(狨猴B95-8)用含20%胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下饥饿培养1～2 w后收集细胞，离心，2 000 r/min×10 min。收集上清，0.22 μm滤膜过滤。

1.3.3 冻存全血法转化永生细胞 采用两种方法冻存全血：方法一，全血中直接添加10%DMSO，每管1 ml冻存;方法二，先配制含20%DMSO的小牛血清冷冻保护液，再添加至全血中，使DMSO的终浓度为5%，每管1 ml冻存。细胞冻存管均放置于程序降温盒中－80℃冰箱过夜后转至液氮冻存。细胞冻存1 w以上后分批在37℃水浴快速复苏，加入8 ml RPMI1640培养基，3 000 r/min离心洗涤2 min，弃上清，细胞沉淀物加入新鲜EBV上清1.2 ml和含20%FBS的RPMI1640培养基1 ml吹打均匀，加入25 ml培养瓶或24孔板中在37℃、5%CO2培养箱中静置培养。

1.3.4 细胞的冻存与复苏 转化成功的细胞生长至一定密度，以含10%DMSO的小牛血清冻存至液氮，在37℃水浴快速复苏进行继代培养。

1.3.5 细胞的HLA基因分型 转化前EDTA抗凝血的DNA提取方法为酚氯仿抽提法，培养后永生细胞株的DNA提取方法为TE试剂盒法。HLA的基因分型采用PCR-SSO荧光微珠流式杂交分型技术对HLA-A、B、DRB1位点进行分型检测。

2 结果

采用冻存全血法转化新疆和田地区长寿老人外周血淋巴细胞，共建立百岁长寿老人永生细胞14株，其中男性8株，女性6株。方法一复苏后显微镜下背景含大量红细胞，观察到淋巴细胞出现转化迹象的时间为15～20 d(图1)，仅建成一株长寿老人永生细胞(1/14)。方法二复苏后镜下背景干净，红细胞残留很少，淋巴细胞出现转化迹象的时间为3～5 d(图2)，转化成功率为100%。转化的B淋巴母细胞经扩增传代培养至第2～3代后冻存至液氮，每株冻存2支。

建成的细胞株冻存后复苏的成功率为100%，经复苏传代扩增培养的细胞生长旺盛，细胞培养至第10代左右时经染色体G显带分析未见异常。对培养的永生细胞提取DNA，与转化前提取的 DNA一同做 HLA基因分型，36号样本为：A2A24B13B35DR7DR11，转化前后结果一致，证明了转化的永生细胞保留了原有个体的完整基因组信息。

图1 方法一转化3 d和10 d时淋巴细胞转化迹象(×200)

图2 方法二转化3 d和10 d时淋巴细胞转化迹象(×200)

3 讨论

EB病毒通过结合人B淋巴细胞表面上的EB病毒受体而感染B淋巴细胞，导致B淋巴细胞的永生性生长，该方法在国外的报道始见于1986年Neitzel等〔7〕，国内最早报道在1995年〔8〕，2002年人类基因组计划后采用该方法大规模转化少数民族永生细胞并建库〔9，10〕，但由于影响转化成功的实验条件很多，国内各实验室之间报道的转化方法和转化效率存在差别〔3〕。

在现有报道的四种EB病毒转化方法中，环孢霉素A法和冻存白细胞法转化效率最高，出现转化迹象最快只需3～5 d，一个月即可成功建系，但该方法需要先用淋巴细胞分离液依据细胞比重不同将淋巴细胞从全血中离心分离出来，再洗涤得到的细胞，该过程步骤多且较费时，淋巴细胞得率影响转化效率，且需要在转化初期加入环孢霉素A以避免转化后T淋巴细胞的免疫效应。微量全血法和冻存全血法所需血量较少，且操作简单，不需环孢霉素A，尤其是冻存全血法可以实现分散采样冻存后集中转化，但这两种方法存在转化效率低、建系周期长的问题，出现转化迹象的淋巴细胞通常要在两周以上才能在密集的红细胞背景下观察到，建系要两个月左右。本研究通过预实验，认为微量全血法和冻存全血法在转化前期的大量红细胞是影响转化成功率和转化周期的一个重要因素，随着红细胞的不断凋亡、裂解，释放出大量血红蛋白和细胞因子，可能会对转化中的淋巴细胞活性产生不利影响〔11〕。

本研究对传统冻存全血法与改进的冻存全血法进行比较，传统冻存全血法中，细胞解冻后存在大量红细胞残留，在显微镜下无法观察到淋巴细胞，而改进后的冻存方法，红细胞残留很少，淋巴细胞活性较好，镜下观察转化背景干净清楚。两种方法的差别主要在于DMSO浓度。红细胞的结构与淋巴细胞存在很大区别，前者无细胞核以及独特的膜结构使其更加脆弱，对冷冻保护剂的分子大小和渗透性要求与淋巴细胞不同，其最佳冷冻保护剂是20%～40%的甘油，在添加及洗脱时还要根据渗透性逐步添加去除〔12〕。DMSO作为渗透性冷冻保护剂，分子量小于甘油，进出细胞速度更快，对淋巴细胞起到很好的冷冻保护作用，在10%的浓度下，DMSO快速出入红细胞膜，部分避免了冻存过程中的冰晶破坏作用，使复苏后红细胞虽然活性大大降低，但仍保持完整膜结构，在随后的培养过程中，红细胞不断裂解，产生碎片，释放出游离血红蛋白，影响了转化中的淋巴细胞活性。在改进的冻存方法中，DMSO浓度降低到了5%，同时添加小牛血清作为非渗透性的保护剂，二者同时存在对淋巴细胞起到了冷冻保护作用，此时5%的DMSO不足以保护红细胞的膜完整性，在复苏后的细胞洗涤过程可以将大量的红细胞残渣去除，避免了其后对淋巴细胞转化的不利影响，实现了转化周期缩短、成功率提高。

本研究首次将改进的冻存全血法用于长寿老人永生细胞的转化，成功率100%，且转化周期与环孢霉素A相同，与传统转化全血法相比，大大提高了转化效率，建立了长寿老人永生细胞株，为进一步的研究提供了充足的实验材料。

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7 Neitzel H.A routine method of the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines〔J〕.Hum Genet，1986;73(3)：320-6.

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