丹皮酚对高血压患者血管内皮细胞Toll样受体4、核因子-κB表达的影响

张竞之 陈小忆 金伟孝 李华锋 区鸿斌 (广州医学院第二附属医院中医科，广东 广州 510620)

高血压(EH)是一种与多因素有关的疾病，其发病机制尚未完全明确。研究表明，血管内皮损伤在原发性高血压的发生发展过程中起重要作用，EH患者的内皮功能均存在不同程度的损伤〔1〕。本研究从Toll样受体信号途径(TLR-NF-κB)入手，通过观察丹皮酚对EH患者血清损伤的血管内皮细胞Toll样受体(TLR4)、核转录因子(NF-κB)表达的影响，从炎症免疫的角度面探讨其保护EH血管内皮细胞损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 病例选择与分组 所选患者均为2007年3月至2008年6月在暨南大学附属第一医院符合世界卫生组织/国际高血压学会统一诊断标准的2、3级EH确诊者。其中，EH组40例，男23例，女17例，年龄50～70岁，平均(65.23±8.46)岁，平均收缩压(168.63±14.45)mmHg，平均舒张压(105.93±8.27)mmHg，入选患者均排除糖尿病、心、脑、肾等靶器官损害及并发症，检查前1 w未服用影响血压的药物。健康组30例，为暨南大学医学院中医系研究生健康志愿者，血压均在正常范围，与EH患者血压比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

1.2 血清收集 患者组及健康对照组均空腹抽血，采血前患者均未使用任何药物，无菌采集前臂静脉血，置入无菌带帽不抗凝干燥试管，自凝后4℃，2 000 r/min离心15 min，取上清液置无菌EP管，恒温水浴箱56℃灭活30 min，－20℃冻存，备用。

1.3 细胞与主要试剂 人脐静脉内皮细胞株HUVEC-C购自武汉“中国典型培养物保藏中心”。DMEM培养基、南美胎牛血清购自Gibco公司。TaKaRa SYBRR ExScript TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司。荧光定量PCR特异性引物由上海英骏生物技术有限公司合成。蛋白Marker购自Invitrogen公司。H-TLR-4一抗购自Santa公司。H-NF-κBa一抗购自 CST公司。二抗购自Cell Signal公司。ECL发光试剂盒购自Cell Signal公司。PVDF膜购自Axygen公司。丹皮酚购自中国药品生物制品检定所，批号：110708-200505。脂多糖(LPS)系北京普博欣生物技术有限公司生产。

1.4 细胞培养与条件培养基配制 人脐静脉内皮细胞株HUVEC-C培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，隔天换液，0.25%胰酶消化传代。丹皮酚母液的配制：20 mg丹皮酚溶于2 ml DMEM中，使其溶浓度为10 g/L，4℃避光保存。LPS母液的配制：1 mg LPS溶于1 ml DMEM中，使其溶浓度为1 g/L，4℃避光保存。条件培养基按实验设计如下配制：EH组：10%EH患者血清 +90%DMEM;健康组：10%健康人血清 +90%DMEM;LPS 诱导组：8 990 μl DMEM+1 000 μl健康人血清 +10 μl LPS 母液;丹 皮 酚小 剂量 (100 μg/ml)组：8 890 μl DMEM+1 000 μl健康人血清 +100 μl丹皮酚母液 +10 μl LPS母液;丹皮酚中剂量(200 μg/ml)组：8 790 μl DMEM+1 000 μl健康人血清+200 μl丹皮酚母液+10 μl LPS母液;丹皮酚大剂量(320 μg/ml)组：8 590μl DMEM+1 000 μl健康人血清 +400 μl丹皮酚母液 +10 μl LPS 母液。

1.5 Real-time PCR法检测TLR4 mRNA的表达 EH组、健康人组、不同浓度丹皮酚组细胞在37℃、5%CO2条件下培养24 h后(检测NF-κB时培养2 h)，采用Trizol法提取各样品总RNA，测定纯度并定量后参照试剂盒使用说明书合成第一链cDNA，于PTC-200型梯度PCR仪上42℃反应15 min，95℃反应2 min。取2 μl cDNA样本按照10倍梯度稀释，依次稀释成共6个浓度梯度的cDNA，制备成阳性定量标准品梯度，倍比稀释一定要准确。每次上机必须新鲜配制阳性定量标准品梯度，正式上机时以包含所有样本的梯度上机进行Real-time PCR反应。目的基因TLR4正义链引物：5'-TGC AAT GGA TCA AGG ACC AG-3'，反义链引物：5'-TGA GGA CCG ACA CAC CAA TG-3'(147 bp)。目的基因IκBa正义链引物：5'-CCT GCA CTT GGC CAT CAT C-3'，反义链引物：5'-TGC TGC AGG TTG TTC TGG AA-3'(105 bp)。内参 β-actin正义链引物：5'-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3'，反义链引物：5'-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3'(106 bp)。反应条件为：95℃ 5 s，然后60℃ 20 s，共40循环。反应结束后，由电脑自动生成荧光扩增曲线、标准曲线以及溶解曲线。使用最大二阶倒数法进行分析。

1.6 Western印迹法检测TLR4、IκBa蛋白的表达 各组细胞在37℃、5%CO2条件下培养(检测TLR4时，细胞培养24 h，检测IκBa时，细胞培养1 h)，用细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50 μg总蛋白样品煮沸变性后，SDS-PAGE电泳，随后电转移至硝酸纤维素膜上，将膜用双蒸水漂洗后放入含有封闭液的容器中，室温下脱色摇床上4℃振荡过夜。加入用TBS/T稀释至适当浓度的一抗，4℃振荡过夜。TBS/T洗膜。加入封闭液稀释的二抗，4℃振荡过夜，TBS/T洗膜。将膜与ECL反应5 min后，曝光、显影、定影、分析。

1.7 统计学处理 采用 SPSS16.0统计软件包，计量数据以s表示，组间比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 EH患者和健康人血清处理对TLR4基因表达的影响HUEVC-C用EH患者血清和健康人血清分别培养24 h后，TLR4基因在EH患者组的表达明显高于健康组〔(8.259 8±0.268 5)×10－4vs(5.416 0 ±0.248 8)×10－4，P ＜0.01〕，说明EH患者组较健康组存在着严重的炎症反应和免疫紊乱。

2.2 丹皮酚对细胞TLR4 mRNA表达的影响 见表1。丹皮酚对LPS引起的TLR4高表达有明显的抑制作用，呈剂量依赖性地阻断这种反应(P＜0.01，P＜0.001)，说明丹皮酚可作为TLR4活化抑制剂，调控了细胞内TLR4的表达。

表1 丹皮酚对细胞TLR4 mRNA，IκBa mRNA表达的比较( s，n=30)

表1 丹皮酚对细胞TLR4 mRNA，IκBa mRNA表达的比较( s，n=30)

与LPS诱导组比较：1)P ＜0.01，2)P ＜0.001

97.356 9±0.959 9 0.066 5±0.000 7丹皮酚小剂量组 10.706 5±0.665 71) 0.097 3±0.000 31)丹皮酚中剂量组 7.199 4±0.093 92) 0.135 7±0.001 62)丹皮酚大剂量组 6.440 3±0.127 12) 0.142 5±0.001 22)Ba LPS诱导组组别 TLR4值( ×10－4)Iκ

2.3 丹皮酚对细胞 IκBa mRNA表达的影响 见表 1。HUEVC-C用LPS诱导1 h后，IκBa基因表达明显低于健康组(P＜0.001)，而丹皮酚对LPS引起的IκBa降解有明显的抑制作用，从而抑制了NF-κB的活化，且呈剂量依赖性，说明丹皮酚可作为NF-κB活化抑制剂，调控细胞内NF-κB的表达。

2.4 丹皮酚对细胞TLR4蛋白表达的影响 见图1。HUEVCC用LPS诱导24 h后，TLR4蛋白表达明显高于健康组，而丹皮酚对LPS引起的TLR4高表达有明显的抑制作用，说明丹皮酚可作为TLR4活化抑制剂，调控了细胞内TLR4的表达，呈剂量依赖性降低TLR4蛋白的高表达。

2.5 丹皮酚对细胞IκBa蛋白表达的影响 见图2。HUEVCC用LPS诱导1 h后，IκBa基因表达明显低于健康组，而丹皮酚呈剂量依赖性抑制IκBa蛋白的降解。说明丹皮酚可作为IκBa降解的抑制剂，从而抑制了 NF-κB的活化，调控细胞内NF-κB 的表达。

图1 TLR4及β-actin Western印迹结果

图2 IκBa及β-actin Western印迹结果

3 讨论

EH的病因及发病机制至今不明，近年，内皮细胞损伤、炎症、免疫在EH中的作用日渐受到重视，大量研究表明，EH与血管内皮细胞损伤、炎症标志物、免疫功能障碍改变有关〔2～8〕，表明内皮细胞损伤、炎症反应和免疫紊乱在EH的发生发展中扮演着重要角色，为研究EH的发病机制和治疗提供了新的思路。可被LPS诱导的TLR-NF-κB信号途径，最突出的生物学功能就是促进细胞因子合成与释放，参与炎症反应和免疫反应，在内皮细胞参与的炎症免疫反应中表达并发挥作用，因此加深TLR信号系统在EH中作用的理解，可能帮助我们了解EH的发病机制。EH与内皮细胞损伤、炎症、免疫以及TLR-NF-κB信号途径之间存在共同的交叉点，我们的前期研究也证明EH患者血清可致内皮细胞损伤〔9〕，而系列药物都可以降低与炎症免疫密切相关的黏附分子表达〔10～12〕，有内皮细胞保护作用。因为NF-κB的激活可导致内皮细胞黏附分子的表达，所以我们认为这类药物可能作用于TLR-NF-κB信号途径而引起黏附分子表达下降。本结果说明EH患者组较健康组存在着严重的炎症反应和免疫紊乱。

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