乌梅水煎物对实验性溃疡性结肠炎小鼠的作用

何爱明，王乙林，林世明(.福建师范大学福清分校生物与化学工程系，福建福清350300;.福建省福清卫生学校药理教研组 ，福建 福清350300)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)又称为非特异性溃疡性结肠炎，是炎症性肠病的一种，是临床常见的一种消化道疾病，严重影响人类的健康，本病病变主要限于黏膜及黏膜下层，呈连续性非节段性分布，多累及直肠、乙状结肠、左半结肠。临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液样血便、或有便秘、腹胀等消化道症状，常反复发作、缠绵难愈。其病因及发病机制尚未明确。近年来自由基在UC发病机制中的作用已成为研究的重要课题。研究提示，UC的发生、发展与氧自由基诱发的脂质过氧化有关［1］。

多年来，许多学者探索应用中医药治疗UC，乌梅丸被广泛运用于UC的临床治疗［2～4］，收到很肯定的疗效，但均未究其作用机制。乌梅(Fructus Mume)是由蔷薇科植物梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)的干燥近成熟果实加工而成。乌梅始载于《神农本草经》，列为中品。《中国药典)2010年版一部收载的“乌梅”正品有乌梅、乌梅肉和乌梅炭3种，其性味归经皆为酸、涩，平。归肝、脾、肺、大肠经。其功能主治为敛肺，涩肠，生津，安蛔。用于肺虚久咳，久痢滑肠，虚热消渴，蛔厥呕吐腹痛;胆道蛔虫症。

本文通过测定过氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醇(MDA)含量水平的变化，进行探讨乌梅对化学试剂诱导的小鼠UC的作用及作用机制，以期为今后进一步研究提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药品 SOD、MDA试剂盒购于南京建成生物工程公司。其余试剂均为分析纯。

乌梅购于宜又佳连锁药店，由云南白药集团天紫红药业有限公司昆明中药饮片厂生产，取乌梅(去核)加6倍量水，加热煮沸30 min，双层纱布过滤，滤渣再加同样量水，加热煮沸30 min，双层纱布过滤，合并滤液于水浴加热浓缩至所需浓度备用［5］。《中国药典》2005年版一部规定人用剂量为6～12 g/d，因药材水煮浓缩后制备出来的供试液极其黏稠，故高剂量组的给药浓度设定为0.4 g/ml、10 ml/kg。小鼠低、中、高剂量按成人最大剂量的 5、10、15 倍给药，即 2、4、6 g 生药/(kg·d)。葡聚糖硫酸钠(DSS)为上海前尘生物科技有限公司产品。

1.2 仪器 恒温水浴箱为江苏省太仓医疗器械厂产品，低温离心机为珠海黑马医学仪器公司产品。

1.3 动物 健康昆明种小鼠，SPF级，雄性，体重为(20±2)g，90只。由福建医科大学实验动物中心提供，合格证号:闽实动质准第00205号。

2 方法

2.1 造模方法 动物适应性饲养1周后，按体重大小随机分为正常组、模型组、乌梅低、中、高剂量组5组，每组15只。动物禁食不禁水24 h，留取正常组15只动物，其余60只小鼠再参照文献报道［6］，用 3%DSS(分子量 500 000)溶液给小鼠自由饮水，连续7 d。造模期间每天观察小鼠性状、饮食、毛发、活泼状态等。模型建立成功的标志为饮用3%DSS后出现稀便、腹泻、大便隐血(+)或肉眼血便的任一症状。选取造模成功的小鼠随机分入各组。

2.2 给药与标本处理方法 造模成功后，即造模第8天开始灌胃，正常组、模型组分别给予0.33 ml生理盐水灌胃，乌梅低、中、高剂量组分别按设计剂量给药。每天一次，均连续给药10 d，期间除正常组小鼠自由饮用生理盐水，其他各组小鼠自由饮用3%DSS水溶液，并且每天定时称量小鼠体重，进行隐血试验和观察粪便性状。分别在试验第5天、第10天，将小鼠称重，并放入代谢笼中，收集小鼠大便，记录大便性状，且取部分粪便测定隐血。进行疾病活动度(DAI)评分，评分标准见表1。DAI=体重下降分数+大便性状分数+隐血分数。

表1 疾病活动度评分

2.3 组织形态学评分标准与方法 给药结束后脱颈处死小鼠，剪开腹腔，取全段结肠，剪开，生理盐水洗干净，平铺于白板上置于放大镜下肉眼观察结肠大体形态、结肠黏膜损伤情况;将固定的结肠组织进行常规石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察结肠组织形态学变化。按评分标准［7］进行组织形态学评分。

2.4 SOD、MDA的测定 取炎症改变最明显处的结肠粘膜组织，湿重200 mg，用4℃冰生理盐水洗净，除去血污，滤纸吸干，称重用匀浆器在冰浴条件下制成匀浆，低温离心机4 000 r/min离心15 min，取适量上清液分装于EP管，-20℃保存，按试剂盒说明操作检测SOD活力及MDA含量。

2.5 统计学分析 实验数据应用SPSS11.0统计软件进行处理。计量资料采用(±s)表示，组间差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，经方差齐性检验后，方差齐时用 Scheffe法，方差不齐时用Games-Howell法。

3 结果

3.1 小鼠一般情况的影响 试验后第5～6天，造模小鼠出现腹泻、饮食减少、体毛无光泽、第6～7天出现不同程度的肉眼血便，蜷缩，活动减少，体重减轻。经供试品治疗7 d后，乌梅中、高剂量组无肉眼血便，可见松散大便。正常对照组小鼠一般性状无明显改变。

3.2 小鼠的疾病活动度评分 试验结果显示，乌梅低、中、高剂量组的DAI均降低，其中低剂量组与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)，中、高剂量组与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，低剂量组与正常组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，中剂量组与正常组比较具有显著性差异(P＜0.05)，高剂量组与正常组比较无显著性差异。评分结果见表2。

表2 各组小鼠的疾病活动度评分(±s)

表2 各组小鼠的疾病活动度评分(±s)

1)P ﹤0.05，2)P ﹤0.01，与模型组比较;3)P ＜0.05，4)P ＜0.01，与正常组比较。

组别 数量 剂量［g/(kg·d)］评分正常组15 0 0模型组 15 0 10.16±0.36低剂量组 15 2 7.86±0.211)4)中剂量组 15 4 3.35±0.242)3)高剂量组 15 6 2.16±0.172)

3.3 小鼠结肠黏膜损伤与评分 肉眼及光镜下观察模型组黏膜糜烂重，溃疡多而且大，黏膜严重充血、水肿;乌梅高剂量组黏膜糜烂不严重，溃疡小，黏膜充血、水肿程度轻;乌梅低剂量组黏膜糜烂较严重，溃疡仍较明显，黏膜充血、水肿程度亦可见及，无明显减轻;乌梅中剂量组的组织损伤介于高剂量组和低剂量组之间。正常组动物未见及黏膜充血、水肿和糜烂，黏膜光滑平整。评分结果见表3。

表3 肉眼及光镜下观察各组小鼠结肠黏膜损伤与评分的比较(±s)

表3 肉眼及光镜下观察各组小鼠结肠黏膜损伤与评分的比较(±s)

1)P ﹤0.05，2)P ﹤0.01，与模型组比较;3)P ＜0.01，与正常组比较。

组别 数量 剂量 肉眼评分 光镜下评分［g/(kg·d)］正常组15 0 0 0模型组 15 0 7.98±0.29 4.23±0.24低剂量组 15 2 5.98±0.231)3) 4.13±0.263)中剂量组 15 4 4.51±0.232)3) 2.19±0.211)3)高剂量组 15 6 1.16±0.242) 1.18±0.122)

3.4 小鼠结肠组织SOD活力与MAD含量 试验结果显示，乌梅低、中、高剂量组的SOD活力值虽均低于正常组，但均高于模型组，其中低剂量组与模型组比较无显著性差异，中、高剂量组与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，低剂量组与正常组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，中剂量组与正常组比较具有显著性差异(P＜0.05)，高剂量组与正常组比较无显著性差异，结果见表4。测得MDA含量中，乌梅低、中、高剂量组虽均高于正常组但均低于模型组，其中低剂量组与模型组比较无显著性差异，中、高剂量组与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，低剂量组与正常组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，中、高剂量组与正常组比较具有显著性差异(P＜0.05)，结果见表4。

表4 各组小鼠结肠组织SOD活力与MAD含量的改变(±s)

表4 各组小鼠结肠组织SOD活力与MAD含量的改变(±s)

1)P ﹤0.01，模型组比较;2)P ﹤0.05，3)P ＜0.01，与正常组比较。

组别 数量 剂量SOD(U/g) MDA(nmol/g)［g/(kg·d)］正常组15 0 22.65±2.21 8.42±1.52模型组 15 0 11.03±1.95 36.75±2.02低剂量组 15 2 12.25±1.583) 31.16±2.612)中剂量组 15 4 18.28±1.591)2)15.84±1.631)2)高剂量组 15 6 19.32±1.881) 16.25±1.481)2)

4 讨论

DSS诱导的UC是一个重要模型，DSS破坏肠黏膜屏障，使粘膜组织凝固坏死，增加DSS的通透性，促进DSS在结肠中扩散，加重炎症反应［8］。该模型具有操作简单、重现性好、造型时间短等特点。因此比较适合该类药物的研究与筛选。溃疡性结肠炎(UC)是炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的一种，IBD已被公认为是胃肠道中除恶变外最严重的疾病之一，流行病学实验表明，结肠癌的发生、发展与结肠炎症的反复发作密切相关，目前UC的病因与发病机制并不十分清楚。

近年来研究发现，炎症介质(白三烯、前列腺素等)在UC炎症反应中作用倍受重视，氧自由基(OFR)参与并且通过脂质过氧化反应产生这些物质。OFR在UC的发病中起重要作用，细胞中的脂类物质受到OFR作用时，发生脂质过氧化反应，产生一些分解产物，如MDA等。MDA为脂质过氧化的终末产物，其含量反映了组织中过氧化损伤程度。SOD是重要的过氧化物歧化酶，能有效地清除氧自由基，从而抑制肠组织中的脂质过氧化反应，并能稳定细胞膜。SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MAD的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。本研究中，模型组小鼠的DAI评分和大体形态以及组织学评分均明显高于正常组，模型组小鼠结肠中SOD活性显著低于正常组。模型组小鼠结肠中MDA含量显著高于正常组，这些反映了氧化应激过程。尤其是氧自由基诱发的脂质过氧化与溃疡性结肠炎有关［9］，可能是其发病机制之一。

本实验结果表明，自由基与UC的结肠组织损伤密切相关，参考UC的病理过程，用乌梅治疗后UC组织中的MDA含量降低，SOD活性提高，疾病活动度降低，组织病理改变明显减轻，说明UC发病的自由基学说为减少MDA含量以及抗氧化治疗提供了理论依据，降低自由基水平可以为治疗溃疡性结肠炎提供新的途径。

［1］丁伟群，林庚金.溃疡性结肠炎发病中白介素水平的变化［J］.复旦学报，2001，13(4):61.

［2］吴邱保.加味乌梅丸与柳氮磺毗啶治疗慢性溃疡性结肠炎的疗效比较［J］.广东医学院学报，2006，24(5):487.

［3］郭洪波，罗玉梅，王静波.乌梅汤加减治疗溃疡性结肠炎44例［J］.新中医，2007，39(1):44.

［4］董少群，李耀清.乌梅丸加减治疗慢性非特异性溃疡性结肠炎64 例［J］.河南医药信息，2002，10(17):45.

［5］王 璐，张红宇，王 莉.乌梅及其炮制品大鼠长期毒性研究［J］.云南中医中药杂志，2010，31(10):67.

［6］易先国，李 卫，吴海港，等.香连滴丸对溃疡性结肠炎模型小鼠疗效试验［J］.中国兽医杂志，2010，46(11):28.

［7］张 涛，施 斌，陈建永，等.溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜CINC-1及其受体CXCR2的表达及意义［J］.世界华人消化杂志，2009，17(1):78.

［8］刘 颖，王 莹.甘草酸二铵抗大鼠溃疡性结肠炎作用及抗炎机制研究［J］.中国新药杂志，2007，16(14):2027.

［9］刘诗权，于皆平，冉宗学.银杏叶萃取物抗肝纤维化作用的实验研究［J］.中华临床医药，2002，3(11):1.