DW-3000呼吸机所致老年大鼠急性肺损伤模型的建立

刘岩，黄佩佳，刘庆辉，姜学革

解放军总医院 南楼呼吸科，北京100853

通气机相关肺损伤（Ventilator-Associated Lung Injury, VALI）或通气机所致肺损伤（Ventilator-Induced Lung Injury，VILI）是机械通气治疗常见的并发症之一，是由于大潮气量或高气道压通气造成的肺脏局部甚至全身的一种炎症反应[1-2]。在动物实验研究中建立较为典型的VILI模型具有重要的意义，对于成年大鼠的VILI 动物模型国内外研究已经较多，但目前为止，对于老年大鼠VILI动物模型研究尚较少[3]。随实验动物年龄的逐渐增大，其病理、生理过程与成年大鼠有着明显的不同，推测老年大鼠VILI动物模型有着自身的特点。本研究通过大潮气量通气建立老年大鼠的VILI模型，为进一步的VILI实验研究提供帮助。

1 实验方法

1.1 实验材料

选取健康老年雄性SD大鼠20只，26月龄，SPF（Specific Pathogen Free，SPF）级，体重（557±23）g。将大鼠随机分为2组，每组10只。A组为致伤组，大潮气量通气（30mL/kg），呼吸频率20次/min；B 组为对照组，小潮气量通气（8mL/kg），呼吸频率40次/min。气源为空气，通气时间4h。呼吸机采用DW-3000（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司生产）。DW-3000呼吸机是定容型正压呼吸，以电机为动力，由驱动电路控制，有节律地输出气流，经吸气管进入动物肺内，使肺扩张，以达到气体交换的目的。

1.2 动物准备

称取大鼠体重后用10%水合氯醛（0.3g/kg）于腹腔内注射麻醉，将其固定于手术台，行气管切开及气管内插管，给予机械通气后再行颈动脉插管术，采取动脉血行血气分析，尾静脉穿刺维库溴铵（1mg/kg）静脉注射维持肌肉松弛。

1.3 标本采集

通气4h后，颈动脉放血处死大鼠。开胸完整取出肺脏，称取全肺湿重，取1小块右肺组织，用10%甲醛固定留作病理学检查，剩余右肺立即放入冻存管，置-80℃低温冰箱保存。左肺用4℃生理盐水行支气管肺泡灌洗，每次灌洗量为2.5mL，共灌洗3次，收集支气管肺泡灌洗液（Broncho Alveolar Lavage Fluid，BALF）后进行3000r/min离心20min，取上清于-80℃低温冰箱冻存。肺组织匀浆液的制备：右肺组织100mg +生理盐水0.9mL，冰浴下制成10%肺组织匀浆，3000r/min离心20min，取上清于-80℃低温冰箱冻存。

1.4 观察指标

测定各组大鼠各时间点（0h、1h、2h、3h、4h）的动脉血氧分压（PaO2）值，并计算氧合指数（PaO2/FiO2）、肺系数（全肺湿重/体重×100）[4]。BALF中IL-1β、IL-8含量测定采用放射免分析方法。 肺组织匀浆中MDA、T-AOC含量测定采用南京建成生物工程研究所提供的检测试剂盒。HE染色光镜下观察肺组织病理学变化。

1.5 统计学分析

实验数据使用SPSS 10.0统计软件行成组t检验，所测数据以±s表示。

2 实验结果

2.1 氧合指数

两组大鼠PaO2/FiO2在通气前（0h）无统计学差异（P>0.05）；大潮气量通气1h后，A组大鼠PaO2/FiO2与B组比较显著下降，随通气时间的延长，PaO2/FiO2进行性下降（表1）。

2.2 肺系数

A组大鼠肺系数（0.60±0.05）与B组（0.77±0.09）比较升高，且差异具有统计学意义（P<0.01）。

2.3 BALF中IL-1β、IL-8水平

A组大鼠BALF中IL-1β、IL-8水平均较B组升高（表2），且差异有统计学意义。

表2 两组大鼠BALF中IL-1β、IL-8水平

2.4 肺组织匀浆中MDA、T-AOC水平

A组大鼠肺组织匀浆中MDA水平较B组显著增加，而T-AOC水平较B组显著下降（表3）。

表3 两组大鼠肺组织匀浆中MDA、T-AOC的水平

2.5 肺组织病理学改变

光镜下A组大鼠肺泡壁明显充血、增厚，肺泡壁和肺间质内可见大量炎性细胞的浸润及肺泡结构的破坏。B组大鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡壁及间质内无炎性细胞的浸润。

表1 两组大鼠不同时间点的氧合指数（PaO2/FiO2）

3 讨论

急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）和/或急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS）的死亡率高达30%～65%。尽管机械通气能够降低ALI/ARDS的死亡率，但同时传统机械通气（Conventional Mechanical Ventilation，CMV）能造成肺组织的进一步损伤，从而加重ALI/ARDS，甚至导致多器官功能障碍综合征（Multiorgan Dysfunction Syndrome，MODS）。CMV可作用于肺泡上皮细胞、血管内皮细胞等多种细胞，引起其结构和超微结构的改变，通过机械转导机制激活细胞内信号转导系统，基因表达的变化，导致细胞因子/趋化因子的释放，使中性粒细胞活化、募集到肺泡腔，从而导致VALI/VILI。VALI/VILI有着较高的死亡率，进一步研究其发生发展机制具有重要的意义[1,5-7]。

目前，ALI/ARDS的诊断仍广泛沿用1994 年欧美联席会议提出的诊断标准，PaO2/FiO2是反映急性肺损伤程度的重要指标，诊断急性肺损伤很重要的一条标准是PaO2/FiO2≤300。我们的研究表明，大潮气量通气1h后，氧合指数致伤组与对照组比较即开始显著下降，随通气时间的延长，PaO2/FiO2进行性下降。当通气4h后，PaO2/FiO2<300，达到急性肺损伤的程度。肺系数是反映肺组织水肿程度的一个重要指标[4]。大潮气量通气4h后，老年大鼠肺系数致伤组较对照组显著升高，提示大潮气量通气组肺组织有更多水分的潴留，肺组织渗出更为明显。

在VALI/VILI发生机制中，细胞因子是造成肺损伤的重要因素[6]。IL-1β是炎症急性反应早期的重要促炎因子，主要来源于单核/巨噬细胞，能促进内皮细胞粘附白细胞，刺激内皮细胞分泌炎症介质，增加炎性渗出和中性粒细胞溶酶体酶释放及氧自由基产生，促进单核/巨噬细胞释放IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子[8]。本研究表明，DW-3000呼吸机大潮气量通气4h后，老年大鼠BALF中IL-1β的水平较小潮气量通气组显著增加。另一炎性细胞因子IL-8也平行性增高，提示大潮气量通气能够造成肺组织内炎性细胞因子含量的显著增高，并能进一步造成肺组织的损伤。MDA是一种脂质过氧化产物，是检测体内脂质过氧化程度的客观指标[9]。T-AOC是反映机体抗氧化能力大小的指标[10]。此项研究表明，DW-3000呼吸机大潮气量通气4h后，肺组织中MDA含量显著增加，T-AOC显著减退，提示氧化应激参与了VILI的发生发展过程。总之，我们的研究表明，DW-3000呼吸机大潮气量通气4h后能够成功复制老年大鼠急性肺损伤的动物模型。

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