水稻稻瘟病抗性基因研究进展

李 婷，王建龙

(1湖南农业大学农学院，长沙410128;2作物基因工程湖南省重点实验室，湖南长沙410128;3湖南金健种业有限公司，常德415000)

水稻(Oryza sativa)属于世界上最重要的粮食作物之一，全世界有50%以上人口的主食都是水稻。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻最严重的病害之一。据研究统计，稻瘟病使全球每年水稻产量损失大概占总产量的10% ～15%，造成经济损失达数10亿美元[1]。中国是世界人口最多的国家，也是水稻种植面积最大的国家，稻瘟病每年都有不同程度的发生，特别是近几年，在西南、长江中游和东北等几大水稻种植区持续发生，年发病面积达330万～570万hm2，产量损失达数亿公斤，给我国粮食安全带来了巨大隐患[2]。

生产上一般运用农药防治和培育抗稻瘟病的品种来控制稻瘟病的发生，但两种方法都有一定的局限性:农药对环境污染大，费用高，长期使用会导致稻瘟病菌产生抗药性;由于稻瘟病菌生理小种组成复杂多变，致病性变异频繁，含有单一抗性基因的抗病品种在种植3～5年后往往会丧失抗性。因此，为了实现经济节约和环境友好型且稳产高产型的绿色种植，探索新型的广谱抗瘟基因和主效QTL，采用聚合育种等方法，选育出稳定、持久、广谱的水稻抗性品种，是目前防治稻瘟病最经济有效的方法。不断挖掘新的抗性资源，鉴定新的抗瘟基因，尤其是从地方品种中发掘具有持久抗性的资源对水稻抗稻瘟病育种具有很重要意义。

1 抗病基因的结构

在过去的数十年间，已经有超过100个植物抗病基因得到克隆，通过分析它们的结构，发现一些保守基序存在高度的同源性。例如NBS(nucleotidebindingsite)结构域、LRR(leucine rich repeat)结构域、TIR(toll interleukin－1 receptor)结构域、CC 结构域(coiled－coil)、TM(trans membrane)结构域、KIN(kinase)结构域、LZ(leucine zopper)结构域等。根据这些特点，人们把抗病基因分成四类:NBSLRR，RLK，LRR－TM 和 TM －CC。在这 4类中，NBS－LRR是其中最大的一类，在水稻中将近有500个这样的基因。目前已经有22个稻瘟病抗性基因被克隆，除了Pid－2和Pi21外，其余基因均编码具有NBS－LRR保守结构域的蛋白。

NBS是NBS－LRR结构域中最保守的部分，由激酶1a(kinase－1a)或磷酸结合环(p－loop)，激酶2(kinase－2)和激酶3a(kinase－3a)3个结构组成。LRR结构域因亮氨酸在结构中呈规律性的重复而命名。每个LRR的结构模式相对很不规则，多样性高，基本结构为LXXLXXLXXLXLXXXX。

2 水稻抗稻瘟病基因的鉴定及定位

稻瘟病抗性的遗传分析工作最早可以追溯到1922年，但并没有同步进行水稻品种抗稻瘟病基因的系统分析研究。20世纪60～80年代中期，日本学者Kiyosawad等对水稻品种抗稻瘟病基因深入研究分析，鉴定了最开始的14个主效抗稻瘟病基因(Pita，Pita2，Pik，Pikp，Piks，Pikm，Pikh，Piz，Pizt，Pia，Pib，Pish，Pii，Pit)，并组成了一套鉴定抗稻瘟病基因分析用的体系(JCD)，每个JDC只携带一个稻瘟病抗性基因[3]。随后，国际水稻所(IRRI，International Rice Research Institute)，中国和韩国等主产稻国家，借助日本的JDCs，也逐渐开展了关于水稻稻瘟病抗性遗传的系统性研究，并应用自己建立的近等基因系或筛选的抗源材料，陆续发现了一批抗病新基因[4]。至今已有超过85个抗稻瘟病基因[5]和350个QTL[6]被报道，分布在除第3号染色体外的 11 条染色体上[7]，除了 Pi21，Pi34，Pi35，Pb1，Pif，Pikur1，Pikur2，Pi－se1 属于部分抗性基因外，其他都是主效基因(表1)。

表1 已鉴定和定位的水稻稻瘟病抗性基因Table 1 Summary of blast resistance genes identified and mapped in rice

有趣的是，许多抗性基因都成簇分布在水稻的染色体上，特别是在第6，11，12号染色体上表现尤为明显。6号染色体上至少有14个基因(Pi2，Piz，Piz－t，Pi8，Piz－5，Pi9，Pi13，Pi13，Pi25，Pi26，Pi27，Pigm，Pid2和Pi40)被定位在着丝粒附近的区域内，其中已经被成功分离的Piz－t，Pi2和Pi9位于相同的区域。Pi9[8]是该位点上第一个被克隆的基因，也是已克隆的基因中抗谱最广的。最近一个新的抗瘟基因Pi50(t)，也被定位在该区域[9]。研究发现，该区域由多个串联的NBS－LRR结构组成[10]。在水稻第11号染色体长臂端，至少存在9个水稻抗瘟基因(Pi1，Pi7，Pi18，Pi34，Pi38，Pi44，Pik － m，Pif，Pilm2)和Pik基因的6个等位基因位点(Pik，Piks，Pik－p，Pik－m，Pik－h，Pik－g)，其中，Pikm 已经利用图位克隆分离[11]。在第12号染色体着丝点附近的区域内，至少含有16个抗瘟基因(Pita，Pita－2，Pitq6，Pi6，Pi12，Pi19，Pi20，Pi21，Pi24，Pi31，Pi32，Pi39，Pi62，Pi157，Pita － 2，Pita)。Monosi[12]通过对水稻NBS－LRR结构域的全基因组图谱数据进行研究，表明上述3个水稻抗瘟基因簇内含有大量的NBS－LRR结构域。

Pi5[13]被定位于水稻第9号染色体，抗性供体为RIL260。在温室人工接种条件下，对 PO6－6等5个稻瘟病菌小种表现完全高抗性。通过功能互补验证与基因测序，发现该基因与另一个主效抗瘟基因Pik－m[14]结构相似，也由两个独立遗传的NBS－LRR类基因(Pi5－1和Pi5－2)共同起作用，并且这2个基因的蛋白产物在氨基端都存在着CC结构。通过基因表达分析，发现其中Pi5－1是受病原菌诱导表达，Pi5－2是组成型表达[15]。序列分析发现Pi5－1有5个外显子，蛋白产物含有1 025个氨基酸;Pi5－2含有6个外显子，编码1 063个氨基酸。

3 水稻抗稻瘟病基因的克隆

随着水稻基因组测序的完成和分子生物技术的迅速发展，越来越多的水稻抗瘟基因被定位和克隆，为水稻抗病基础研究和育种工程打下了坚实的基础[16]。其中，在已鉴定的主效抗瘟基因中，已有22个基因通过图位克隆、电子克隆，或转座子标签等各种方法被成功克隆(表2)。

表2 已克隆的稻瘟病抗性基因Table 2 Cloned rice blast resistance genes

在上述已被克隆的抗瘟基因中，有20个为主效基因(Pib、Pita、Pi9、Pi2、Piz － t、Pid2、Pi36、Pi37、Pikm、Pit、Pi5、Pid3(Pi25)、Pikh(Pi54)、Pish、Pik、Pia、Pikp、Pi54rh)，2 个为主效 QTL(Pb1、Pi21)。分析这22个已经被克隆的抗瘟基因，除了Pid－2和Pi21外，其他20个基因都编码具有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复(LRR)保守结构域的蛋白。

Pi－b[17]是第一个被克隆出来的抗瘟基因，抗性供体是BL1，定位于水稻第2号染色体长臂端。该基因对日本的多数稻瘟病菌生理小种表现抗性。Pi－b由229 bp的3'－UTR和4个内含子(163，810，1340，308 bp)的 ORF 等结构组成，它编码一个NBS－LRR类蛋白产物，该产物由1 251个氨基酸所组成。此外，Pi－b基因蛋白的LRR结构域由17个不完整的LRR组成，结构域的中部又有8个成簇的半胱氨酸残基，且单个重复的氨基酸的数目在19～29个不等。研究表明，该基因的表达受环境的影响，如温度、光照以及水杨酸、茉莉酸、乙烯等条件的改变都会影响其表达。

Pi54rh[18]是一个最新从野生稻中发现并克隆的广谱抗瘟基因，同样属于CC－NBS－LRR家族，它含有一个特殊的锌指结构域。Pi9[8]，被定为于6号染色体上，与 Pi2、Piz－t、Piz互为等位基因。通过抗谱鉴定，该基因对来自13个国家和地区的43个稻瘟病生理小种表现高抗，而Pi2对其中的36个稻瘟病生理小种表现高抗。Pi21[19]为表现部分抗性的主效QTL，是目前唯一一个隐形基因，被定位在第12号染色体上，抗性供体为Suweon 365，它能编码富含脯氨酸的蛋白(proline－rich protein)，包括在蛋白的N端具有重金属结合域(heavy metal associated domian)以及蛋白互作的基序(motif)。Pb1[20]的抗性供体为籼稻品种Modan，是目前唯一一个抗穗颈瘟的主效QTL，该基因的抗性强弱与表达水平高低有关，基因编码CC－NBS－LRR蛋白，含有1 296个氨基酸。

4 分子标记技术在稻瘟病抗性基因研究及水稻抗病育种中的应用

与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记对抗源的有效应用极为重要，同时也是图位克隆该基因的基础和前提。第一代分子标记是基于DNA杂交技术为基础的分子标记，如限制性片段长度多态性分子标记(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。RFLP是应用最早的分子标记技术，广泛应用于早期抗病基因定位工作中。20世纪80年代，McCouch等利用135个RFLP分子标记构建了一张覆盖水稻12条染色体，共1 389 cM的遗传图谱[21]。但由于RFLP对DNA的需求量大，操作复杂，费用昂贵，分析速度慢，同位素检测对人体有害等缺点，在大规模应用中受到限制。在聚合酶链式反应(PCR)技术发明以后(1987年，Mullis和Faloona)，因其操作比较简单，成功率较高，后期涌现了一大批以PCR技术为基础的分子标记技术[22]，如简单序列重复分子标记(simple sequence repeat，SSR)。由于SSR具有重复性高，品种间多态性丰富，可靠性高，快速简便，对DNA质量要求不高等诸多优点，已被广泛应用到基因定位等相关领域。随着测序技术的迅猛发展，越来越多的物种的基因组测序完成，分子标记技术也得到了不断的提高和完善。如今，不仅核基因组的卫星DNA被广泛用于分子标记来检测遗传多样性，一些其他细胞器的卫星DNA也用来作为分子标记，例如，叶绿体卫星 DNA[23]，线粒体卫星 DNA[24]等。

Pi40[25]是一个抗谱很广的稻瘟病抗性基因，来源于水稻品种IR65482－4－136－2－2，被定位于标记S2539和RM3330之间的70 kb的区域[26]。该基因对来自于韩国、菲律宾的多个稻瘟病菌小种都表现抗性。Pi35能解释69.4%表型变异的QTL，被Ngugen等成功定位于1号染色体SSR标记RM1216和RM1003之间的3.5 cM 内。Liu[27]等综合应用SSR和RFLP两种分子标记技术从三黄占2号中定位了控制病斑叶面积60.3%的变异的5个抗瘟性QTLs。Miyamoto[28]等对抗稻瘟病基因 Pi－ b 进行了精细地位，该基因位于12号染色体长臂，标记RZ123和RAPD标记b－1共分离。Pid3是未经定位直接利用Nipponbare中的假基因设计分子标记，通过得到与感病表型共分离的分子标记，而获得的一个抗瘟基因[29]。

传统的水稻抗性育种主要通过鉴定抗性和选择表型来实现，包括人为创造的增压选择，这些都要求育种家具备丰富的实践经验，并且所花费的时间较长，效率相对低，外界环境对其影响较大。随着分子标记辅助育种(MAS)的发展，通过利用与目的基因紧密连锁的分子标记对目标性状进行间接选择，加快了分析速度且操作简便。研究表明，当分子标记距离目的基因的遗传距离小于5 cM时，能选择到含有目的基因的植株的正确率在99.75%以上[30]。

5 问题与展望

(1)已有稻瘟病抗性基因研究大都集中在几个大的基因簇上，如Pi9和Pik基因家族，这些基因家族在不同的水稻品种中含类似等位的抗性基因，但是存在抗谱差异。通过对表现高抗的水稻品种的抗性基因进行同源克隆和功能鉴定，可在育种过程中发现新的抗性基因。稻瘟病抗性材料与感病材料中的等位基因可能只是一个或几个氨基酸的不同，且稻瘟病抗性材料中的抗性基因往往含有多个候选基因，如Pi9和Pi50。除了功能基因外，其余都是假基因，它们之间有着复杂的进化关系，一般认为这是进化过程中的抗性基因通过重组、缺失、点突变或串联重复形成的，阐明这些进化关系，可能提供新的发掘稻瘟病抗性基因的途径。

(2)转基因技术被称为第二次“绿色革命”[31]，这场技术革命将可能使全球农业发生深刻的变革。同样，转基因技术也将用于植物抗病研究中，如多基因聚合等。2008年起，国家及各地已陆续启动了水稻转基因抗病分子育种重大专项，这样更加快了水稻抗稻瘟病基因的研究与应用的步伐。但是，目前的植物抗病基因研究存在一些问题，如转基因多拷贝诱发的基因沉默和转基因体系多代后外源基因丢失，转基因植物环境释放的生态风险评估等问题引起了广泛的争议。

(3)通过常规育种或分子育种等手段将多个基因转育到同一品种中，这种方法称为基因聚合。在稻瘟病抗性育种中，也广泛采用了这种方法。刘士平等研究表明，基因聚合后抗谱增宽，抗性增强，说明基因聚合是培育稻瘟病持久抗性品种的有效方法[32]。

因为水稻稻瘟病菌生理小种的高度复杂和频繁变异，注定了稻瘟病的长期存在。为了减少稻瘟病带来的产量和经济损失，必须发掘和鉴定更多的抗稻瘟病基因，并研究在育种和栽培过程中怎样合理利用它们，如及时了解当地稻瘟病生理菌群的动态变化，科学更替水稻抗病新品种，最大限度地延长水稻品种抗性;准确预测稻瘟病生理菌群结构的变化，筛选合适的主效抗瘟基因，并搭配多个微效基因，选育出携带多个基因的聚合系水稻品种，进而提高抗性。

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