株两优819杂交制种的适宜收获期研究

舒志芬，刘 晨，张海清

(湖南农业大学农学院，长沙410128)

株两优819是株1S和华819所配制的两系杂交组合。其母本株1S配合力强，至2008年已配制并通过省级、国家级审定的杂交早稻组合有28个，其中株两优02、株两优819、株两优30被评为省或国家广适型超级杂交早稻组合，具有广阔的推广前景［1～3］。株1S所配杂交组合制种产量虽高(大面积制种产量达3 750 kg/hm2)，但连续几年来普遍反映所生产杂交种子发芽率较低，常给种子生产者和用种者带来一定损失［4］。付爱斌等［5］认为，陆两优996制种种子适宜收获期在母本终花后第14～17天，该时期收获的种子籽粒饱满，成熟完全，物质积累充分，发芽率(势)高，种子电导率低，POD、CAT活性强，种子活力高。王仁祥等［4］研究表明，株两优02和株两优819制种适时收获期分别为母本终花后第11～16天、第12～17天。但上述试验都是在自由授粉条件下以获得的种子批为研究对象，由于母本始花至终花需要经历较长时间，自由授粉会导致同一株母本不同小花接受花粉的时间差别较大，进而导致同一批收获的种子其成熟度可能存在较大差异，因而不能客观反映种子本身的成熟度对种子活力的影响。笔者及课题组以株1S为母本、华819为父本，将用于制种的父母本进行隔离避免其自由授粉，在盛花期对母本进行集中授粉，以保证同批收获的种子成熟度一致，进而对不同收获期的种子千粒重、发芽率、SOD酶及POD酶活性、外渗电解质(H+、K+、可溶性糖)含量、淀粉含量等进行测定，在保证种子发芽率和种子活性的情况下，以此确定株两优819种子的最佳收获期，旨在为大田生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试杂交种为株两优819，母本为株1S，父本为华819。亲本种子由湖南农业大学农学院提供。

1.2 田间制种

制种于2011年在湖南农业大学长安教学试验基地进行。父本先播，母本于父本播后8 d播种，父母本行比2∶12，父母本分别于4.5叶龄左右移栽，母本每穴2～3株秧苗，株行距15 cm×20 cm。父本大双行移栽，两行间35 cm，株距15 cm，每穴5株，父母本间20 cm。母本见穗35%时，连续2 d喷施“九二O”共240 g/hm2，并用薄膜将母本包围与父本隔离，并在之后的第7天开始连续集中2 d人工授粉(9:00开始每间隔半小时授1次粉至16:00，次日重复操作)。母本授粉后的第10天起，连续16 d每2 d收获1期种子，干燥至12.5%含水量，低温贮藏备用。

1.3 千粒重测定

取1 000粒种子，称出其重量，重复3次，取平均值。

1.4 发芽率测定

发芽床用滤纸做床纸，将两片滤纸用蒸馏水浸透，放入无菌的发芽盒中，平放至滤纸间无气泡。水稻种子在常温下浸种24 h后，置于垫有两层吸水纸的发芽盒中，每次取100粒种子，重复3次，置于30℃恒温光照发芽箱内培养，每天对发芽种子计数，至第7天结束，计算发芽率。

1.5 保护酶系活性测定

1.5.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

酶液提取:取1.0 g吸胀种子，用液氮研磨成粉，加入5倍于样品量的酶提取液0.2 mol/L磷酸二氢钠在冰浴上研磨成匀浆。将匀浆在4℃下以12 000 r/min离心20 min，取其上清液。

蛋白质定量:用考马斯亮蓝G－250染色法测定酶粗提取液的蛋白质含量。

(1)标准曲线的绘制:取6支具塞试管，分别编号0～5，加入标准蛋白质溶液和蒸馏水。向各支试管中加入5 mL考马斯亮蓝G－250溶液，摇匀，放置5 min左右，在595 nm下比色测定吸光值。以蛋白质含量为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

(2)样品标定:称取0.5 g样品，用5 mL蒸馏水或缓冲溶液研磨成匀浆后，以10 000 r/min离心10 min，吸取样品上清液1.0 mL，放入具塞试管中，每个样品重复2次，加入5 mL考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，测定吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。

式中:c—从标准曲线上查得的蛋白质含量(μg);VT—提取液总体积(mL);VS—测定时加样量(mL);mF—样品质量(g)［8］。

酶活性的测定:取透明度好、质地相同的试管2支，一支为对照组，将两支试管中按比例(1∶1∶1)加入13 mmol/L甲硫氨酸溶液、75 μmol/L NBT溶液、10 μmol/L EDTA －Na，混合后，依次加入适量 20 μmol/L核黄素溶液和酶液，给对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套避光，反应10～20 min，结束后，用黑布罩上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，用分光光度计在560 nm波长下测定各管的吸光值，计算SOD活性。

式中:A0—遮光对照管的吸光值;AS—样品管的吸光值;VT—样液总体积(mL);V1—测定时样品用量(mL);mF—鲜样品质量(g);c—粗酶液中的蛋白质含量(mg/g)［7］。

1.5.2 过氧化物酶(POD)活性测定

粗酶液的提取:称取1.0 g浸种3 d后的水稻种子，用9 mL pH=7.0的磷酸缓冲溶液研磨并转移至离心管，于4 000 r/min离心15 min，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用磷酸缓冲液提取1次，合并两次缓冲液，保存在4℃冰箱中。

酶活性的测定:每个样准备两个试管，测定管和对照管。测定管中依次加入2.9 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液、1.0 mL质量分数为2%的H2O2、1.0 mL 0.05 mol/L愈创木酚以及0.1 mL样本上清液。反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴15 min，然后迅速转入冰浴中，在470 nm下测量每分钟吸光度变化值，以表示酶活性大小。对照管中用蒸馏水代替样本上清液作为对照。3次重复，计算POD酶活性。

结果计算:以每分钟OD470变化0.01为一个活性单位。

式中:ΔOD470—每分钟底物溶液吸光值的变化;m—材料质量(mg)［7］。

1.6 外渗电解质的测定

1.6.1 K+的测定

取0.190 7 g的KCl(110℃烘2 h)溶于无离子水中，定容至1 L。吸取 100 ppmKCl标液 2、4、6、8、10、12 mL于50 mL容量瓶中，用水定容。在火焰分光光度计上测定K+含量，制作K+标准曲线。取水稻种子5 g用无离子水25 mL浸种4 h后，吸取待测液2.5 mL定容至25 mL，取浸种液喷入火焰，记录火焰光度计指针读数，重复3次，从标准曲线上查出相应的 K+的浓度［7］。

1.6.2 H+的测定

取5 g种子浸在25 mL无离子水中4 h，取其浸种液，把酸度计两电极放入盛有浸种液的烧杯中，混合均匀，读出浸种液的 pH［7］。

1.6.3 可溶性糖外渗量的测定

(1)200 mg/L葡萄糖标准溶液:准确称取AR级D－葡萄糖200 mg，加蒸馏水定容至1 000 mL。

(2)葡萄糖标准曲线的绘制:取6支试管编号1、2、3、4、5、6，分别在 6 支试管中加入葡萄糖标准液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，加水 2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 mL。然后在每支试管中加入0.5 mL蒽酮试剂，再用移液管加入5 mL浓H2SO4，摇匀，反应10 min，在620 nm波长下比色，测定各管的吸光值。

(3)吸取2 mL浸种液于大试管中，加入0.5 mL蒽酮试剂，再用移液管加入5 mL浓H2SO4，摇匀，反应10 min，在620 nm波长下比色，测定各管的吸光值。

(4)根据所测得光密度，在标准曲线上查出糖含量(μg)，计算浸种液的可溶性糖含量。可溶性糖浓度(μg/mL)为查图所得糖含量(μg)/2 mL［7］。

1.7 淀粉含量的测定

(1)淀粉标准曲线的绘制

取6支试管编号 1 ～6，分别加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL淀粉标准液。然后分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL 蒸馏水，摇匀，则每管依次含淀粉 0、40、80、120、160、200 μg。

向每支试管中加入0.5 mL蒽酮试剂，再沿管壁加5.0 mL浓H2SO4，塞上塞子，微微摇动，促使乙酸乙酯水解，当管内出现蒽酮絮状物时，再剧烈摇晃促进蒽酮溶解，然后立即放入沸水浴中加热10 min，取出冷却。

在分光光度计上625 nm波长下比色，测出各管的吸光度。

以吸光度值为横坐标，淀粉含量为纵坐标，绘制淀粉标准曲线求得直线回归方程。

(2)样品淀粉含量测定

将种子放于70～80℃的烘箱中烘至恒温，将种子磨成粉末，称取50 mg，倒入10 mL试管中，加4 mL80%乙醇水浴锅中不断搅拌40 min，冷去后离心，倒掉上清液。再加2 mL80%的乙醇重新提取2次，过滤，将残渣烘干。

将干燥的残渣，移入50 mL容量瓶中，加20 mL蒸馏水，放入沸水浴中加热15 min，再加入2 mL9.2 mol/L HClO4提取15 min，冷却后用蒸馏水定容、摇匀。

用滤纸过滤，滤液用来测定淀粉含量。

吸取滤液0.5 mL放入小试管中加1.5 mL蒸馏水，加0.5 ml蒽酮试剂，然后沿管壁加5.0 mL浓H2SO4，塞上塞子，微微摇动，促使乙酸乙酯水解，当管内出现蒽酮絮状物时，再剧烈摇晃促进蒽酮溶解，然后立即放入沸水浴中加热10 min，取出冷却，测出样品在625 nm波长下的吸光度，通过直线回归方程计算淀粉的含量［7］。

2 结果与分析

2.1 不同收获期种子千粒重、发芽率和淀粉含量比较

从表1可以看出，授粉后第10～26 d收获的种子，随着种子成熟度的提高，种子的千粒重、发芽率与淀粉含量逐步升高，至第8期达到最高，分别为20.67 g、96.33%、54.74 μg/g，而第 9 期略有下降。说明在第8期(授粉后第23～24 d)收获的种子活力最高，第8期以前的种子仍在进行物质积累，没有达到完全成熟，而第9期收获的种子成熟过度，可能发生物质淋溶情况，其淀粉含量、千粒重和发芽率均出现下降趋势。

表1 不同收获期种子千粒重、发芽率和淀粉含量比较

2.2 SOD酶活性与POD酶活性

从图1看出，第1期至第8期收获的种子SOD酶活性呈现出缓慢增长的趋势，在第8期酶活性达到最高，第9期略有降低。不同收获期的种子POD酶活性总体呈现逐渐增大的趋势，第1期至第4期收获的种子POD酶活性较低，第4期后收获的种子POD酶活性快速增加，至第8期收获的种子POD酶活性达到最高。由此可见，第8期收获的种子抗逆性较强，种子活力高。

图1 不同收获期种子SOD酶与POD酶活性比较

2.3 外渗电解质

从图2可知，第1期至第8期收获的种子，其外渗溶液中K+浓度总体上呈现出下降趋势，但是在第9期收获的种子其浓度稍有上升，说明成熟度差的种子细胞完整性差、透性大，浸泡液中低分子物质含量较多，因而外渗电解质浓度高。随着种子成熟度的提高，种子的外渗电解质浓度逐渐降低。在第9期收获的种子成熟过度，导致收获的种子细胞膜受损，K+浓度略有上升。

第1期至第7期收获的种子pH值呈现上升的趋势，即外渗电解质溶液中H+浓度呈现下降趋势，但第8期与第9期收获的种子pH值呈现下降趋势，即H+浓度开始增加，说明第7期与第8期收获的种子细胞完整性好，种子活力高。

图2 不同收获期种子外渗电解质及可溶性糖浓度比较

2.4 可溶性糖含量比较

随着种子成熟度的增加，种子中的可溶性糖会不断转换成不溶性的淀粉贮藏在种子中。从图2还可以看出，第1期至第4期收获的种子的可溶性糖含量呈现缓慢下降趋势，第5期收获的种子可溶性糖含量快速下降，之后收获的种子可溶性糖含量保持稳定，但是在第9期收获的种子其含量呈现略微增加。

3 小结与讨论

研究结果表明，在本试验设计的9个收获期内，以第8期收获的种子发芽率最高，其种子的千粒重和淀粉含量也最高，说明在此时期收获的种子成熟度高，物质积累充分。从酶活性测定结果来看，在第8期收获的种子SOD酶与POD酶活性最高。种子的外渗电解质浓度与种子的活力呈显著的负相关关系，第8期收获的种子的外渗电解质浓度较低，种子细胞膜的完整性好，透性小，这期间收获的种子具有较高的活力。因此，株两优819制种在第1至第7期收获的种子未完全成熟，处于物质逐渐积累和种子活力逐步提高的阶段，至第8期收获的种子已经成熟完全，种子的千粒重和淀粉含量达到最高，种子发芽率也达到最高，种子活力和抗逆性最强。第9期收获的种子成熟过渡，出现物质外渗现象，种子活力下降，发芽率降低。说明株两优819制种最佳的收获期是在第8期，即母本授粉后第23～24 d。

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