2011年南京市外环境水体及水产品致病性弧菌污染状况分析

花蕾 程婷婷

2011年南京市外环境水体及水产品致病性弧菌污染状况分析

花蕾①程婷婷①

目的：了解南京市外环境水体与水产品中致病性弧菌污染状况，预防和控制此类食物中毒的发生。方法：采集外环境水体与水产品，用碱性蛋白胨水增菌、庆大琼脂、TCBS琼脂、科玛嘉弧菌显色琼脂分离，对分离出的致病性弧菌进行系统生化鉴定，对分离出的霍乱弧菌用血清学和多重荧光PCR方法进行分型与毒力检测。结果：2011年共采集南京市外环境水体与水产品共151份，其中检出致病性弧菌8种，共38株，检出率依次为霍乱弧菌7.28%、副溶血弧菌5.83%、嗜水气单胞菌4.64%、溶澡弧菌3.33%、温和气单胞菌3.31%、创伤弧菌1.67%、梅氏弧菌0.83%、类志贺邻单胞菌0.83%。其中分离出的霍乱弧菌均为非01/非0139群霍乱弧菌且不携带霍乱肠毒素。结论：2011年水产品中非01/非0139群霍乱弧菌污染较为严重，其次为副溶血弧菌、创伤弧菌等；外环境水体中嗜水气单胞菌污染较为严重，需加强外环境水体与水产品的监测，做好预防控制疾病工作。

致病性弧菌； 外环境水体； 水产品； 霍乱肠毒素

致病性弧菌广泛分布于海水、淡水、海产品中，人类摄入或接触污染的水源和食物易引起感染。近年来，有关致病性弧菌引起卫生健康事件时有报道[1-3]。为了解南京市外环境水体及水产品中致病性弧菌的污染状况，采用传统培养法进行分离培养鉴定，并进行毒力检测，为及时发现、及时预测疫情和制定防治策略提供依据。现将南京市疾控中心2011年对151份外环境水体及水产品监测情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集与种类

1.1.1 外环境水体 取自南京市中山陵燕雀湖，每个取样点分成相隔数米的位置，分别用灭菌采样瓶采集，共31份。

1.1.2 水产品 取自南京市下关区惠明桥水产品批发市场，共120份。

1.2 试剂与仪器 法国梅里埃ATB生化鉴定仪、ABI 7500 Fast型实时荧光定量PCR仪。弧菌科玛嘉显色培养基及ID32E生化试剂条均购自法国梅里埃公司。碱性蛋白胨水、TCBS选择性琼脂、庆大选择性琼脂由环凯公司生产。霍乱弧菌DNA多重荧光PCR试剂盒购自厦门百维信生物科技有限公司。霍乱弧菌诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司。均为有效期内使用。

1.3 检测方法 霍乱弧菌依据《霍乱防治手册》，其他弧菌依据《全国临床检验操作规程》进行检测。样本接种碱性蛋白胨水培养37 ℃ 8 h，取菌膜下表层培养物再次接种碱性蛋白胨水二次增菌培养37 ℃ 8 h，取二次增菌液培养物转种庆大选择性琼脂、TCBS选择性琼脂、弧菌科玛嘉显色琼脂培养37 ℃ 24 h，挑取可疑菌落转种双糖铁琼脂、营养琼脂，纯化的菌种进行生化及血清学检测，生化结果符合霍乱弧菌的菌株用四重荧光PCR方法进行分型与霍乱肠毒素检测。

2 结果

2.1 外环境水体、水产品致病菌检测情况 2011年采集南京市外环境水体、水产品样本共151份，检出致病性弧菌8种，共38株。外环境水体中检出3种致病性弧菌，分别为嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和非01/非0139群霍乱弧菌，其中嗜水气单胞菌检出率最高，达16.2%；水产品中非01/非0139群霍乱弧菌检出率最高，达8.33%，其次为副溶血弧菌、溶藻弧菌等7种其他致病性弧菌。见表1。

2.2 血清学方法检测霍乱弧菌 对分离出的11株霍乱弧菌经血清凝集试验均为自凝菌，无法分型。

表1 外环境水体、水产品致泻性弧菌检测情况

2.3 多重荧光PCR方法对霍乱弧菌分型和毒力检测 对分离出的11株霍乱弧菌进行四重荧光PCR检测，分别针对霍乱弧菌hlyA基因、霍乱01菌群特异性基因01rfb、霍乱0139菌群特异性基因0139rfb和霍乱产毒基因ctxA，结果均为霍乱弧菌hlyA基因阳性、其他三种基因阴性，故均判定为非01/非0139群霍乱弧菌，不携带霍乱肠毒素。

3 讨论

2011年对31份外环境水体检测结果显示，嗜水气单胞菌为主要污染菌，检出率达16.2%，其次为温和气单胞菌检出率为6.45%。人类感染气单胞菌主要以肠道感染为主，所感染的气单胞菌以嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌为主[4]。气单胞菌可产生肠毒素、溶血素、细胞毒素等，均有较强的致病性，免疫功能低下或合并慢性疾病患者易感染，且可发生肠道外感染，如心内膜炎、咽炎、肺炎、胆囊炎等，甚至出现败血症、感染性休克和肺水肿等严重并发症[5]。目前，国外已将嗜水气单胞菌纳入腹泻病原菌的检测范围，是食品卫生检测的对象，下一步本实验室还将对所分离的菌株做进一步毒力基因测定和耐药性试验。

2011年对120份水产品检测，非01/非0139群霍乱弧菌检出率为8.33%，在所有检出的致病性弧菌中排列首位。近年来国内外关于非01群霍乱弧菌致病的报告逐渐增多，在国内非01/非0139群霍乱弧菌是引起夏、秋季腹泻和食源性疾病的主要病原菌，据报道其发病率有超过沙门菌、志贺菌[6]。霍乱弧菌致病关键因素是霍乱肠毒素（CT）和毒素共调菌毛（TCP）。霍乱毒素基因ctxAB并非为霍乱弧菌所固有，而是由霍乱弧菌染色体上的一种溶原性噬菌体基因组所携带，该单元可被诱导为形成新的子代噬菌体，整合入受体菌染色体上特异位点，会导致毒素基因在产毒株和非产毒的非致病性菌株间的水平转移。CT是由ctxAB基因编码；TCP作为定植因子，由tcp基因编码。研究表明，霍乱弧菌存在ctxA+tcpA+、ctxA-tcpA+、ctxA-tcpA-的致病相关基因模式，提示tcp是获得CTX因子的前提，tcp的表达对于CTX因子在有毒株和无毒株问的转移至关重要[7]。提示缺少CT的菌株可能通过与产毒性01、0139霍乱弧菌不同的机制引起人体腹泻。当菌株缺失部分或全部CTX毒力因子上的基因时，可能产生其他毒素，如NAG-特异性热稳定毒素、热稳定直接溶血素、志贺样毒素等，它们在致腹泻的机制中可能起到某种促进的作用。此次分离出的非01/非0139群霍乱弧菌经检测均不携带霍乱肠毒素，但未检测tcp及其他毒素，不排除有获得霍乱肠毒素及携带其他毒素的可能，需进一步检测，并引起有关部门的高度重视，及时制订有效的、针对性强的预防控制措施。

本次检测从水产品中还检出副溶血弧菌、创伤弧菌等其他致病性弧菌。其中副溶血弧菌7株，分离自花螺、龙虾和扇贝，分离率仅次于非01/非0139群霍乱弧菌。副溶血弧菌是引起食源性疾病的重要病原之一，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。创伤弧菌检出2株，分离自海螺和章鱼。创伤弧菌能够引起胃肠炎、伤口感染和原发性败血症，通常人类感染是因为食用生或半生的受污染海产品。创伤弧菌是美国海产品消费引起死亡的首要原因，美国州际贝类卫生委员会（ISSC）规定，收获后经处理的牡蛎中创伤弧菌限量不超过30 CFU/g[8]。由于人们饮食习惯的改变，对于海产品等的食用量增加，生吃水产品的品种越来越多，人群暴露的机会和规模都呈上升的趋势，造成食物中毒的潜在危险，致泻性弧菌成为感染性腹泻的主要致病菌。同时，食品加工存在生熟不分、加热不透现象，饮食卫生环节存在薄弱环节，因此，必须进一步加强对外环境，尤其是水产品的监测，掌握病原菌分布特点，研究其与人群发病的关系，以便及时采取措施降低危害。依据此次监测结果显示，生食水产品极易引起食物中毒，因此，相关部门要积极采取措施，加强宣传，教育市民食用水产品一定要煮熟、煮透，尽量避免生食、半生食，又做到刀板、食具、容器生熟分开，操作过程中防止交叉污染，并防止由此引起的食物中毒。

[1] 邱波，王本利.一起食物中毒分离出溶藻弧菌的病原学研究[J].职业与健康，2004，20（11）：65-66.

[2] 秦树民，冯艳洁.一起副溶血性弧菌食物中毒引起的类霍乱样腹泻[J].中国卫生检验，2008，18（6）：1202.

[3] 白丽娜，张敬党.一起由嗜水气单胞菌引起食物中毒的病原学调查[J].现代预防医学，2008，35（7）：1360-1362.

[4] Altwegg M，Geiss H K．Aeromonas as a human pathogen[J]．Crit Rev Microbiol，1989，16（1）：253-286．

[5] 蒲增惠，于红霞.成人急性感染性腹泻中气单胞菌的分离与临床分析[J].中华传染病杂志，2010，28（6）：379-380.

[6] Kan B，Xu J G.New problems of cholera surveillance[J].Disease Surveillance，2006，19（1）:16-17.

[7] 王鸣，李孝权.2001至2005年广州地区霍乱弧菌相关基因体征分析[J].中华预防医学杂志，2006，40（4）：257-261.

[8] Panicker G，Bej A K．Real-time PCR detection of vibrio vulnificus in oysters：comparison of oligonucleotide primers and probes targeting vvhA[J]．Appl Environ Mierobiol，2005，71（10）：5702-5709．

Analysis on Polluting Situation of Causative Vibrio in External Environmental Water and Sea Products in Nanjing Area from 2011

HUA Lei，CHENG Ting-ting.

Objective:To understand contamination status of external environmental water and sea products in Nanjing，prevention and treatment of food poisoning.Method:External environmental water and sea products samples were collected，samples were proliferated in alkaline liquid mediam，and purified in Gentamycin Agar， Thiosulfate-Citrate-Bile-Sucrose agar and chromager vibrio colored agar，The virulence gene and phenotype of the isolated strains were detected by coagulation with diagnostic serum and multi-fluorescent PCR.Result：2011 In Nanjing，collection a total of 151 environmental water and sea products，with 38 strains of eight kinds of causative vibrio isolated， the rates of isolation of V.chelera，V.parahaemolyticus，Aeromonas hydrophila，V.alginalyticus，Aeromonas mild，V.vulnicus， V.metschnikovi，Plesiomonas shigelloides were 7.28%，5.83%，4.64%，3.33%，3.31%，1.67%，0.83% and 0.83%，respecvtively.The vibrio cholera were Non-01 Non-0139 vibrio cholera and not carry cholera toxin.Conclusion：In 2011，sea products from Non-01 Non-0139 vibrio cholera polluted more serious，Secondly，Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus etc，in external water， aeromonas hydrophila relatively serious， must to strengthen the monitoring and disease prevention of environmental water and aquatic products.

Causative vibrio； External environmental water； Sea products； Choler toxin

The Center for Disease Control and Prevention of Nanjing, Nanjing 210003, China

/Medical Innovation of China，2012，9（34）:003-005

10.3969/j.issn.1674-4985.2012.34.002

①南京市疾病预防控制中心 江苏 南京 210003通讯作者：花蕾

2012-09-03） （本文编辑：连胜利）