高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的研究

刘 晶 王 雪 张佳宁 李 越 王校红 于殿宇

(东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030)

(黑龙江省粮食科研所2，哈尔滨 150030)

高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的研究

刘 晶1王 雪1张佳宁1李 越1王校红2于殿宇1

(东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030)

(黑龙江省粮食科研所2，哈尔滨 150030)

研究了以醋酸纤维素/聚丙烯复合膜为载体的高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的固定化条件，采用响应面分析法对固定化条件进一步优化，并对固定化酶膜的酶学性质进行了讨论。结果表明，以固定化酶活力为指标，当高碘酸钠浓度为0.15 mol/L，活化为60 min时，浓度为0.013 g/mL的酶液与pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液于戊二醛质量分数0.24%，温度4℃下，进行交联反应，反应3.1 h后，获得的固定化酶活最高，为0.52 U/cm2。固定化酶膜的酶学性质为:固定化酶最适温度35℃，最适pH为9.0。

高碘酸钠 醋酸纤维素/聚丙烯复合膜 脂肪酶 固定化

脂肪酶是一种广泛分布于动物、植物和微生物中的酶，能够进行可逆的甘油酯键水解或合成。在一定的条件下，脂肪酶可以主要催化合成反应，即可以用来合成生物柴油。无论在小规模的实验还是工业规模的酯合成中，作为催化剂，脂肪酶已经得到成功应用［1－4］。固定化酶技术，就是将酶结合在载体上，或将其限制在有限空间内的一类技术，酶仍能进行相应催化活性，并方便回收利用［5］。一般将酶的固定化技术分为酶与载体的结合和包埋两大类。其中结合法包括物理吸附、离子吸附、共价键结合及交联法等［6－9］。

固定化方法是否成功很大方面取决于选择合适的载体。固定化载体的选择主要考虑是否拥有固定化所需的最佳性能，如机械强度、稳定性、亲水疏水性、孔隙度、反应性、再生性及经济性等方面［10］。常用的载体主要有微晶纤维素、硅藻土、硅胶等。而以膜为载体，不仅结合了膜的分离功能，还结合了载体功能和分隔功能，具有其他载体不可比拟的优点［11］。醋酸纤维素/聚丙烯复合膜具有一定的吸附性、化学稳定性好、疏水性、机械性能优异等优点，根据复合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和产品的生产。传统的固定化方法都有自己的优缺点，因此不能绝对说哪种方法优于其他的方法，要针对固定化对象本身的特点和所要应用的环境来选择最适合的方法［12］。

本试验以醋酸纤维素/聚丙烯复合膜为载体，由于纤维素表面有大量的羟基，因此用高碘酸钠氧化法来氧化活化载体膜，进而更好的固定化脂肪酶，再以交联的固定化方式，采用响应面分析法确定了最佳的固定化条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

脂肪酶:Sigma公司;聚丙烯，上海硕光电子科技有限公司;高碘酸钠，氢硼化钠:分析纯，广东东莞市大岭山公司;磷酸二氢钾，磷酸氢二钠:天津市光复精细化工研究所;聚乙烯醇:国药集团化学试剂有限公司;橄榄油:中国医药上海化学试剂;其余试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

磁力搅拌器85－2型:江苏中大仪器厂;LG10－2.4A型高速离心机:北京市医用离心机厂;电子天平:梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 醋酸纤维素/聚丙烯复合膜的制备

将5 g醋酸纤维素溶于100 mL丙酮中，待溶解完全成均一的膜液后，取试验前制备好的聚丙烯膜浸于溶有醋酸纤维素的丙酮溶液中，自然成膜，以去离子水冲洗醋酸纤维素/聚丙烯复合膜数次干燥备用［12］。

1.3.2 高碘酸钠氧化法

取一张醋酸纤维素/聚丙烯复合膜悬浮于10 mL不同浓度的高碘酸钠溶液中，室温下置于摇床中摇动一定时间，取出立即用去离子水洗至中性，吸干水分，与酶的磷酸盐缓冲溶液于28℃进行交联反应。交联反应后取出，悬浮于10 mL 1%氢硼化钠溶液中于4℃反应30 min，然后用0.1 mol的HAI溶液、2 mol的KCl溶液和水分别洗涤3次，取出测定酶活［13－14］。

1.3.3 脂肪酶活力测定(橄榄油乳化法)

将一定量的聚乙烯醇溶液和橄榄油按照一定的体积比(3∶1)混合，再用超声波乳化成乳状液。取4 mL乳化液和5 mL一定pH的缓冲液加入一定量的酶，预热5 min后，同时在另一三角瓶中加入乳化液作空白样，反应15 min后，向两瓶中加入15 mL 95%乙醇，终止反应，用0.05 mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定，计算可得脂肪酶的分解活力。测定固定化酶酶活时将已固定化酶的滤纸剪碎，平均分成两份，其中一份做空白［15－16］。

水解橄榄油每min产生1 μmol游离的脂肪酸定义为一个酶活力(U)。

式中:V为样品所消耗碱的体积/mL;V0为空白样品所消耗碱的体积/mL;t为反应时间;n为稀释倍数;50为1 mL 0.05 mol/L氢氧化钠的微摩尔数。

固定化酶活定义为:每平方厘米固定化酶膜在37℃，pH 9.0的条件下，水解脂肪每分钟产生1 μmol的脂肪酸所消耗的酶量，用U/cm2表示。

2 结果与分析

2.1 固定化条件对固定化酶活的影响

2.1.1 不同高碘酸钠浓度及活化时间对固定化酶活的影响

分别选取不同高碘酸钠浓度和不同活化时间对固定化酶活进行考察，结果如图1所示。

图1 不同高碘酸钠浓度下活化时间对固定化酶活的影响

由图1可知，当NaIO4(高碘酸钠)浓度为0.15 mol/L时，氧化时间为60 min时，所获得的固定化酶的酶活最高，而随着氧化的时间延长，固定化酶的活力减弱。氧化程度通常由膜表面上的羟基被氧化成醛基的量来表示。由于醋酸纤维素/聚丙烯复合膜表面有大量的羟基，易于高碘酸钠氧化羟基成醛基，利于下一步的交联反应。

2.1.2 交联剂浓度对固定化酶活的影响

分别选取0.15% ～0.4%不同浓度的交联剂(戊二醛)对固定化酶活进行考察，结果如图2所示。

图2 戊二醛浓度对固定化酶活的影响

由图2可知，当交联剂质量分数为0.25%时固定化酶活力最大，当交联剂质量分数低于0.25%时，固定化酶活随交联剂浓度的增大而增加，而高于此值后固定化酶活力逐渐下降。

2.1.3 交联时间对固定化酶活的影响

交联时间是一个需要严格控制的操作条件，试验选取1～6 h对交联时间进行考察，结果如图3所示。

图3 交联时间对固定化酶活的影响

由图 3 可知，在交联时间为 1、2、3、4、5、6 h 时，对酶的固定化效果分别进行测定。在1 h时，酶活力还很低，只有0.42 U/cm2，说明大部分的酶还没有被交联上，继续延长交联时间，2 h时活力上升为0.48 U/cm2，到3 h 时，酶活力最大，为 0.54 U/cm2，再继续延长交联时间，酶活力开始下降，到5 h后，酶活力变化趋于稳定，不再继续下降。说明3 h为最佳交联时间。

2.1.4 酶液浓度对固定化酶活的影响

在高碘酸钠浓度为0.15 mol/L，氧化时间为60 min的条件下，氧化活化后的醋酸纤维素/聚丙烯复合膜悬浮于不同酶浓度的pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中交联3 h，试验选取0.02～0.2 g/10 mL酶液浓度进行考察，结果如图4所示。

图4 酶浓度对固定化酶活的影响

由图4可知，当酶的质量浓度为0.015 g/mL时固定化效果最好。当酶的质量浓度低于0.015 g/mL时，固定化酶的酶活随酶浓度的增大而增加，而高于此值固定化酶酶活不再增加。因此，确定酶液质量浓度为 0.015 g/mL。

2.2 回归方程的建立与分析

由单因素试验可以看出在脂肪酶的固定化过程中，交联时间、交联剂浓度、酶液浓度对固定化酶活力影响较大，而高碘酸钠的浓度及活化时间主要是对酶膜上的羟基进行氧化，对固定化的整个过程有影响，而要确定固定化条件主要是对交联时间、交联剂浓度及酶液浓度进行优化即可。因此，在交联时间3 h，交联剂浓度0.25%，酶液浓度0.15 g/10 mL基础上采用中心组合设计(Box － Benhnken)［17］，以交联时间(A)、交联剂浓度(B)和酶液浓度(C)为自变量，固定化酶活力(Y)为响应值设计响应面试验。自变量水平编码见表1，试验设计方案及结果见表2。

表1 因素水平编码表

表2 响应面设计方案及试验结果

利用Design Expert 7.0.0软件对试验结果进行方差分析，结果见表3(P＜0.05为显著项)。

通过对试验数据进行多元回归拟合，得到酶活力(Y)对自变量交联时间(A)、交联剂浓度(B)和酶液质量浓度(C)的回归方程为:

Y=0.52+8.750E －003A －8.750E －003B －0.040C+2.500E － 003AC+2.500E － 003BC －0.033A2－0.038B2－0.041C2

由表3可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著(P＜0.000 1)失拟项不显著(P ＞0.05)，并且该模型 R2=97.98%，=95.38%说明该模型与试验拟合良好。由表3还可以看出，脂肪酶的固定化过程中的 A、B、C、A2、B2和 C2为显著影响因素。图5为交联时间与交联剂浓度、交联时间与酶液质量浓度和交联剂浓度与酶液质量浓度的交互作用对酶活力的响应曲面图。

表3 方差分析结果

图5 不同因素交互影响酶活力的等高线和响应面图

由图5a可知，酶活力的极值出现在试验范围内，在交联时间为2.5～3.5 h，交联剂质量分数约为0.25%时，酶活力在0.5 U/cm2以上。

由图5b可知，酶活力的极值出现在试验范围内，在酶液质量浓度为0.13～0.18 g/10 mL，交联时间约为3 h时，酶活力在0.5 U/cm2以上。

由图5c可知，酶活力的极值出现在试验范围内，在交联剂质量分数为0.23% ～0.28%，酶液质量浓度为0.15 g/10 mL时，酶活力在0.5 U/cm2以上。

应用响应面优化分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果见表4。

表4 响应面寻优结果

为检验响应面方法所得结果的可靠性，按照上述整理值进行试验，得到的酶活力为0.52 U/cm2。预测值与试验值之间的良好拟合性证实了模型的有效性。表明所得出的回归方程可以很好的反映交联时间、交联剂浓度和酶液浓度与酶活力的关系。因此响应面分析法所得到的固定化条件参数准确可靠，在实践中具有可行性。

2.3 固定化酶最适温度和pH稳定性

2.3.1 固定化酶的最适温度

在高碘酸钠浓度为0.15 mol/L，氧化时间为60 min的条件下，氧化活化后的醋酸纤维素/聚丙烯复合膜悬浮于浓度为0.013 g/mL的酶液，在pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中交联3.1 h，进行固定化脂肪酶。将在上述条件下固定化的脂肪酶，分别在不同温度条件下测定酶活并与游离酶作比较，结果如图6所示。

图6 温度对固定化酶活及游离酶的影响

由图6可知，固定化酶的最适温度与游离酶接近，但是固定化酶活随温度变动的幅度比游离酶小。以上结果说明，该固定化酶对温度的敏感性更稳定，不易失活。

2.3.2 固定化酶的最适pH

选择不同的反应pH，按上述测定固定化酶最适酶学性质的步骤进行试验，结果如图7所示。

图7 PH值对固定化酶活及游离酶的影响

由图7可知，通过比较固定化酶和游离酶对pH的敏感性发现，固定化酶的最适pH为9.0，说明固定化酶受微环境的影响比游离酶小，且固定化后的脂肪酶的pH变化范围不大。

3 结论

本试验研究了以醋酸纤维素/聚丙烯复合膜为载体的高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的固定化条件，基于高碘酸钠的氧化活化作用下，酶分子能够更好地与载体相交联，并采用响应面分析法优化固定化条件，通过试验确定了:当高碘酸钠浓度为0.15 mol/L，活化60 min，交联剂质量分数为0.24%，与质量浓度为0.013 g/mL的酶和pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液交联3.1 h后，获得的固定化酶酶活最高，为0.52 U/cm2。采用响应面优化的结果进行进一步试验讨论了固定化后的脂肪酶的pH及温度稳定性，结果是pH变化范围不大，且对温度的敏感性更稳定，最适pH为9.0，最适温度为35℃。

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Study on the Lipase Immobilization by Means of Sodium Periodate Oxidation

Liu Jing1Wang Xue1Zhang Jianing1Li Yue1Wang Xiaohong2Yu Dianyu1
(College of Food Science，Northeast Agricultural University1，Harbin 150030)
(Hei Long Jiang Food Scientific Institute2，Harbin 150030)
(School of Food Science and Technology，Northeast Agricultural University3，Harbin 150030)

The lipase was immobilized on the acetylcellulose/polypropylene composite membrane by Sodium periodate oxidation and the response surface analysis was used to further optimize immobilized conditions，and then discussed the properties of immobilized enzyme membrane.The results indicated that the optimal conditions of the immobilized lipase are:with immobilized enzyme activities for index，the sodium periodate concentration was 0.15 mol/L，activated 60 min，which the lipase concentration was 0.013 g/mL with cross－linking agent concentration was 0.24%under the phosphate buffered solution of pH was 8.0，then after the time of adsorption － crosslinking for 3.1 h of temperature at 4 ℃，separately.The lipase activities were 0.52 U/cm2，and the optimal pH of the immobilized lipase was 9.0，the optimal operating temperature of the immobilized lipase was 35 ℃.

sodium periodate，acetylcellulose/polypropylene，lipase，lmmobilization

TS229

A

1003－0174(2012)04－0068－06

国家科技支撑计划(2011BAD02B01)

2011－08－24

刘晶，女，1986出生，硕士，粮食油脂及植物蛋白工程

于殿宇，男，1964年出生，教授，大豆油脂加工技术