高压氧对急性运动大鼠腓肠肌细胞凋亡的影响

姜振 张林

1 盐城师范学院体育学院（江苏盐城224002）

2 苏州大学体育学院

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞死亡过程，其性质为生理性细胞死亡。长时间、大强度运动引起的自由基增多、Ca2+浓度增加、线粒体膜电位下降，是导致肌肉组织微细结构损伤与细胞凋亡，导致运动能力下降的重要原因［1］。运动后为了加快消除疲劳、促进恢复，要先解决组织缺氧和消除代谢产物的问题。目前，国内外有不少高压氧疗法对运动性肌损伤与疲劳恢复影响的报道［2，3］，而应用高压氧对力竭运动后骨骼肌Bcl-2蛋白与Caspase 3蛋白影响的报道鲜见。本研究分别对比安静对照组、安静高压氧组、急性力竭运动组和急性运动高压氧恢复组，观察应用高压氧恢复对大鼠腓肠肌细胞形态结构、Caspase3和Bcl-2蛋白表达的影响，探讨高压氧对大鼠运动性骨骼肌细胞形态结构损伤与细胞凋亡相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组与实验地点

32只7～8周龄雄性SD大鼠，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，生产许可证号SCXK（沪）2007-0005。标准辐射灭菌啮齿类动物饲料饲养，自由饮水，动物饲养室温度22～24℃，湿度40%～70%。经过1周饲养适应，大鼠体重190～210 g，将其随机分为4组：安静对照组、安静高压氧组、急性力竭运动组的急性运动高压氧恢复组，每组8只。本实验于2010年6月在苏州大学运动人体科学实验室完成。

1.2 运动方案和供氧条件

急性力竭运动组和急性运动高压氧恢复组进行速度为25 m/min、坡度为10%的一次性大强度跑台运动至力竭。大鼠力竭判定标准：大鼠跟不上跑台预定速度，臀部压在跑台后壁，后肢随转动皮带后拖达30 s，毛刷刺激驱赶无效；行为特征为呼吸急促，神情疲倦，俯卧位垂头，刺激后无反应。

急性运动高压氧恢复组大鼠运动后即刻，采用0.2 MPa压力高压氧恢复60 min。安静高压氧组大鼠与安静对照组一起饲养，取样前置于0.2 MPa压力高压氧舱60 min。

应用DW-400型动物氧舱 （山东潍坊锅炉氧舱制造公司），纯氧洗舱10 min，以0.01 MPa/min的速率加压至 0.2 MPa（绝对压），高压停留 40 min，期间以纯氧通风10 min，使舱内氧浓度>98%，CO2浓度<0.05%，舱内温度维持在22～24℃。暴露结束后，匀速减压10 min至常压出舱。

1.3 取样方法

对照组、急性运动组与高压氧恢复组于运动后1 h，安静高压氧组于应用高压氧舱后即刻麻醉，使用戊巴比妥钠腹腔注射，快速取出一部分腓肠肌放入液氮冷冻，后置于-80℃冰箱冷藏保存备用。同时另取部分腓肠肌10%甲醛固定，用于制作切片。

1.4 指标测试

1.4.1 HE染色

按照试剂盒说明进行操作：①组织脱蜡，水化切片，酒精梯度复水；②苏木精染液染色，分化、漂洗；③伊红染液染色；④脱水、烤片与封片。染色采用碧云天生物技术研究所生产的试剂盒。

1.4.2 腓肠肌细胞中Caspase 3、Bcl-2蛋白表达的免疫组化检测

Caspase 3、Bcl-2蛋白表达测定采用武汉博士德公司提供的试剂盒。①脱蜡、水化，方法同上。②双氧水（H2O2）孵育，PBS洗涤。③热修复抗原。④封闭抗原。⑤加入适当稀释的一抗（LSAB复合物，博士德公司产品）。⑥滴加二抗。⑦DAB显色。⑧苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察并拍片。

图像分析与阳性率计算：每张切片同一部位随机选取6个不同视野进行观察，采用OLYMPUS BX52显微照相图像采集系统拍片，于40×10倍镜下计数阳性细胞数和总细胞数，应用Simple PCI图像分析软件分析，计算每组细胞的阳性率。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 腓肠肌细胞形态结构（图1）

在HE染色片中，显微镜下可见，急性力竭运动组大鼠腓肠肌细胞间隙增宽，肌纤维排列不规则，部分细胞核染色质浓缩靠近核膜、核膜增厚等典型细胞凋亡的形态结构改变。急性运动高压氧恢复组大鼠腓肠肌细胞间隙与肌纤维排列接近对照组，细胞凋亡现象较急性力竭运动组明显减少。与安静对照组相比，安静高压氧组无明显变化。

2.2 腓肠肌Bcl-2蛋白表达

图2显示，安静对照组Bcl-2蛋白表达很少，急性力竭运动组Bcl-2蛋白表达较多，急性运动高压氧恢复组表达最高。由表1可见，急性力竭运动组和高压氧恢复组Bcl-2蛋白阳性率显著高于安静对照组（P<0.01），运动高压氧恢复组Bcl-2蛋白阳性率高于急性力竭运动组，但无显著性差异（P>0.05）。

表1 各组大鼠腓肠肌Bcl-2蛋白阳性率比较

2.3 腓肠肌Caspase 3蛋白表达

图3显示，与安静对照组相比，安静高压氧组Caspase 3蛋白表达很少，急性力竭运动组表达较高，运动高压氧恢复组有少量表达。由表2可见，急性力竭运动组和急性运动高压氧恢复组大鼠腓肠肌Caspase 3蛋白阳性率显著高于安静对照组 （P<0.01），急性运动高压氧恢复组Caspase 3蛋白阳性率显著低于急性力竭运动组（P<0.01）。

表2 各组大鼠腓肠肌Caspase 3蛋白阳性率比较

3 讨论

高压氧疗法通过吸入高压氧气，提高血液氧分压而影响机体各系统器官代谢和功能。长时间剧烈运动造成机体吸氧量与需氧量之间的不平衡，限制机体利用氧的能力。高压氧可快速提高组织氧含量及氧储量，改善组织缺氧，减少细胞凋亡。刘鹏程［4］研究发现，高压氧对清除运动后大鼠骨骼肌细胞凋亡具有显著效果。金其贯等［5］研究发现，高压氧处理后，小鼠游泳运动时间明显延长，并且力竭运动后小鼠血清酶、硫化巴比妥酸反应物、亚硝酸根含量改变相对减轻，认为高浓度氧显著提高小鼠运动能力，可能与减轻自由基介导的运动性损伤有关。本实验结果显示，急性力竭运动组大鼠腓肠肌出现明显细胞凋亡，急性运动高压氧恢复组大鼠腓肠肌细胞凋亡明显减少，表明高压氧能抑制力竭运动大鼠腓肠肌细胞凋亡。

Bcl-2是一种参与抑制细胞凋亡的蛋白质，分布在细胞内膜系统，在线粒体膜上分布最多。在其C-末端含有1个19个氨基酸组成的疏水跨膜区，功能是作为1个信号锚定序列，负责定位和插入到线粒体外膜，抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化不产生影响［6］。Bcl-2高表达可防止线粒体膜电位下降，抑制线粒体释放细胞色素C和Ca2+的内流［7］。Bcl-2基因家族包括两大类：抑制凋亡的基因如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等，促进凋亡的基因如Bax、Bad、Bak 等［8］。Bcl-2 表达可抑制细胞自我产生的自由基及细胞外自由基对细胞的毒害与损伤作用，拮抗促凋亡基因Bax，抑制细胞色素C自线粒体释放至胞质，阻止胞质细胞色素C对Caspase蛋白酶的激活，从而抑制凋亡［9］。本实验结果显示，急性力竭运动组与急性运动高压氧恢复组Bcl-2蛋白阳性率显著高于安静对照组，急性运动高压氧恢复组Bcl-2蛋白表达最高，提示高压氧促进Bcl-2蛋白表达，对急性力竭运动大鼠骨骼肌细胞有一定的保护作用。

Caspases是细胞凋亡过程中重要的蛋白酶，凋亡的最后实施是通过 Caspases 的激活实现的［10，11］。Caspases通常以无活性的酶原形式存在，各种凋亡信号激活其上游的Caspases启动子，使Caspases产生“瀑布式”的级联反应，进而激活下游的Caspases效应子，对特定的底物进行切割激活核酸内切酶，抑制DNA修复酶，从而破坏细胞骨架蛋白和核蛋白，使染色体断裂成小片段， 最终导致细胞死亡［12，13，14］。Caspase-3是Caspases级联反应中下行的关键的凋亡执行蛋白酶，在各种启动凋亡的程序中起枢纽作用［15，16］。有研究表明 Bcl-2 调控细胞凋亡的机制是通过防止受损DNA激活凋亡的诱导基因来抑制细胞凋亡［7］。本实验结果显示，高压氧显著下调急性力竭运动大鼠腓肠肌Caspase 3蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，抑制细胞凋亡，促进腓肠肌组织损伤恢复。

4 小结

急性力竭运动大鼠腓肠肌细胞出现凋亡的形态结构变化，Bcl-2蛋白与Caspase 3蛋白阳性表达增加。应用高压氧使大鼠腓肠肌组织抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，抑制促凋亡蛋白Caspase 3合成，对急性力竭运动导致的细胞凋亡有一定的保护作用。

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