彩虹明樱蛤多糖对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用

向 维，陈松华，李朝品

(1.中国人民解放军 南京军区南京总医院 疗养区(全军医学康复中心)，江苏 南京 211131;2.皖南医学院 病原生物学教研室，安徽 芜湖 241002)

我们前面的研究已经证实彩虹明樱蛤多糖(Moerella iridescens polysaccharide，MIP)对小鼠的免疫功能具有一定的调节作用［1］，是一种良好的免疫调节剂。本研究采用小鼠CCl4肝损伤模型，观察了MIP对急性肝损伤的保护作用。

1 材料

MIP的制备同文献［1］。

联苯双酯滴丸(biphenyl dimethy dicarboxylate，BDD)，浙江万邦药业有限公司;氯仿、正丁醇、四氯化碳、橄榄油，国药集团化学试剂有限公司;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

BALB/c雌性昆明种小鼠，13～15周龄，体重18～22 g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，许可证号:SCXK(苏)2007-0001。

721分光光度计，北京瑞利分析仪器公司;CF16RX高速低温离心机，日立公司。

2 方法

昆明种小鼠60只随机等分成6组:正常对照组、CCl4模型组、联苯双酯滴丸组(200mg/kg)、MIP低、中、高剂量组(40，80，160mg/kg)。实验室饲养3 d后，正常对照组及CCl4模型组ip生理盐水;联苯双酯滴丸组和MIP低、中、高剂量组分别ip相应剂量药物的生理盐水溶液。给药体积均为0.1mL/10g，1次/d，连续给药7d。于末次给药2h后，正常对照组ip橄榄油溶液0.1mL/10g，其余5组均ip等量0.1%CCl4橄榄油溶液。禁食不禁水，24 h后称体重，摘眼球取血。血液3 000r/min离心10min，取血清超低温冰箱冻存待测。采血后快速断头处死小鼠，剖取肝脏，取肝右叶组织0.5 g在冰生理盐水中漂洗，滤纸拭干，用生理盐水制成10%肝组织匀浆，离心取上清待测。同时取左叶相同部位肝脏，迅速投入10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，切片HE染色，光镜下观察肝组织切片的病理形态学变化［2］。

按试剂盒说明测定血清ALT和AST，组织匀浆MDA、SOD和GSH。计算肝脏指数:(肝脏重量/体重)。

采用SPSS12.0统计软件进行动物随机分组，各组实验数据均以(±s)表示，样本均数间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肝脏指数检测

MIP中、高剂量组比模型组略有降低，但并无统计学差异，结果见表1。

3.2 血清生化指标检测

小鼠腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液后，小鼠血清ALT、AST水平明显升高，MIP能显著降低肝损伤小鼠血清ALT和AST水平(P＜0.01)，结果见表1。

3.3 肝组织匀浆生化指标检测

与正常对照组比较，CCl4模型组小鼠肝组织中MDA含量明显升高，SOD与GSH活性显著下降，提示肝脏出现脂质过氧化。而MIP中、高剂量组可显著抑制肝组织中MDA的升高(P＜0.01)，并使SOD和GSH活性明显升高(P＜0.05)，提示MIP有较强的抗氧化及清除氧自由基的作用，结果见表2。

表1 MIP对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏指数、血清ALT和AST活性的影响(n=10，±s)Tab.1 Effects of MIPon liver index，and the activities of ALT and AST in serum of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

表1 MIP对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏指数、血清ALT和AST活性的影响(n=10，±s)Tab.1 Effects of MIPon liver index，and the activities of ALT and AST in serum of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

与模型组比较:1 P＜0.05，2P＜0.01Compared with model group:1P＜0.05，2 P＜0.01

MIP 中剂量组 80 463.38±23.46 52.89±12.1489.26±28.89 MIP 高剂量组 160 452.23±27.66 41.28±14.362 74.12±27.972

表2 MIP对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD和GSH的影响(n=10，±s)Tab.2 Effects of MIPon MDA and SOD and GSH in hepatic homogenate of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

表2 MIP对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD和GSH的影响(n=10，±s)Tab.2 Effects of MIPon MDA and SOD and GSH in hepatic homogenate of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

与模型组比较:1 P＜0.05，2 P＜0.01Compared with model group:1 P＜0.05，2 P＜0.01

MIP 低剂量组 40 3.92±1.481 48.23±1.661 28.36±2.281 MIP 中剂量组 80 3.65±0.562 52.77±1.582 31.37±0.761 MIP 高剂量组 160 3.33±0.372 54.49±1.162 33.85±1.332

3.4 肝脏组织病理学观察

正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色，质地湿润、柔软有光泽且富于弹性;光学显徽镜下可见肝小叶结构完整，轮廓清晰;肝细胞排列整齐，大小均匀，分界清楚，无炎细胞浸润;肝细胞胞质丰富，含嗜碱性物质较多，核大而圆，见图1A。CCl4模型组小鼠肝脏体积增大，质脆边缘钝而厚，表面呈黄褐色;镜下见肝小叶结构破坏，肝细胞核消失，出现以中央静脉为中心的局灶性肝细胞变性、坏死和大量炎细胞浸润，见图1B。联苯双酯滴丸组小鼠肝脏颜色较红润，有部分肝细胞有胞浆疏松，气球样变现象，见图1C。MIP低剂量组肝脏虽未完全表现为正常对照组的红褐色，但较模型组有明显改观;切片可见病变以中央静脉周围肝细胞的气球样变为主，肝细胞肿大，胞浆疏松，中央静脉周围有少量肝细胞坏死和炎症细胞入侵，见图1D。MIP中剂量组肝脏颜色较红润;切片可见有部分肝细胞有气球样变，但并无炎症细胞入侵和明显坏死，见图1E。MIP高剂量组小鼠肝脏颜色红润，接近正常对照组，仅有少量肝细胞有胞浆疏松现象，见图1F。

图1 各组肝组织切片HE染色结果(×200)Fig.1 Light microscopy showing liver tissue in each group(HE staining，× 200)

4 讨论

正常肝组织ALT主要分布于细胞浆内，AST则分布于线粒体中。在CCl4模型中，CCl4在肝微粒体细胞色素P450激活下生成三氯甲基自由基，这些自由基可与肝细胞内大分子发生共价结合，也可攻击膜不饱和脂质，引起脂质过氧化，使肝细胞损伤，转氨酶从受损的肝细胞内溢出，使血清中转氨酶升高［3］。因此，ALT和AST的升高是肝炎活动的重要标志。SOD是动物机体内的抗氧化酶，其作用是清除自由基，防止自由基对细胞结构的损伤，体内SOD的活性，可以反映自由基的清除速度。MDA是不饱和脂肪酸氧化作用的终产物，它在血清中的含量可以间接反映自由基反应时组织的破坏程度。MDA的测定常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度［4］。因此，SOD及MDA可反映肝细胞损伤的程度和药物对肝细胞的拮抗作用。GSH广泛存在于人体的各种组织中，GSH水平降低意味着机体抗氧化能力下降，并引发机体的氧化应激反应，产生大量的自由基。在肝脏化学性损伤时，氧化应激消耗GSH引起肝脏GSH含量下降，机体抗氧化能力下降，并引发机体的氧化应激反应［5］。研究证实，多糖能够提高SOD、GSH等抗氧化物酶的活性，降低脂质过氧化物的含量［6］。

本实验结果显示，MIP 3个剂量组能不同程度降低肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝匀浆MDA水平，能不同程度增高肝损伤小鼠肝匀浆SOD和GSH的水平，且对小鼠肝脏的病理学损伤也有明显改善。据此推断，MIP对CCl4引起的小鼠急性肝损伤保护作用的机制可能是通过提高SOD等抗氧化物酶的活性，从而清除自由基，防止脂质过氧化，稳定膜结构，起到保护肝脏的作用。对MIP抗氧化的作用机制有待进一步研究。

［1］向 维，陈松华，李朝品.彩虹明樱蛤多糖对小鼠的免疫调节作用［J］.中国生化药物杂志，2011，32(5):393-395.

［2］陈 奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社，2000:943.

［3］Ozercan I H，Dagli A F，Ustundag B，etal.Does instant coffee prevent acute liver injury induced by carbon tetrachloride［J］.Hepatol Res，2006，35(3):163-165.

［4］Basn S.Carbon tetrachloride induced lipid peroxidation:eicosanoid formation and their regulation by antioxidant nutrien［J］.Toxicology，2003，189(2):113-127.

［5］Mehmetcik G，Ozdemirler G，Kocak T N，etal.Effect of pretreatment with artichoke extracton carbon tetrachloride-induced liver injury and oxidative stress［J］.Exp Toxicol Pathol，2008，60(1):475-480.

［6］周林珠，杨祥良，周井炎，等.多糖抗氧化作用研究进展［J］.中国生化药物杂志，2002，23(4):210-212.