CdS-BSA-CTMAB荧光光度法测定食品中蛋白质的含量

焦 嫚，董学芝，胡卫平，王 鑫

（河南大学化学化工学院环境与分析科学研究所，河南开封475004）

CdS-BSA-CTMAB荧光光度法测定食品中蛋白质的含量

焦 嫚，董学芝*，胡卫平，王 鑫

（河南大学化学化工学院环境与分析科学研究所，河南开封475004）

实验以六偏磷酸钠为稳定剂，巯基乙酸为修饰剂水相合成了荧光试剂CdS量子点。结果表明，牛血清白蛋白（BSA）可使CdS的荧光峰增强，而阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）的加入，可使体系荧光峰显著增敏，并且荧光强度与BSA浓度在8.0×10-5～1.3mg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为F=1486.94793+937.70328C，相关系数R=0.9957，检出限为7.4×10-5mg/mL。方法已用于食品中蛋白质的测定，与考马斯亮蓝法对照，结果满意。

CdS量子点，十六烷基三甲基溴化铵，牛血清白蛋白

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量大，主要由氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构。蛋白质的测定方法主要有滴定法[1]、吸光光度法[2]、荧光法[3]、共振瑞利散射法[4]、电感耦合等离子体法[5]、流动注射法[6]等。荧光法因具有多种测定参数、选择性好、灵敏度高等优点而应用广泛，利用有机染料结合的荧光探针技术也倍受关注[7]。近年来，量子点（QDs）作为一种具有优异光学性质的荧光生物探针，弥补了传统有机染料存在的缺陷，在蛋白质分析方面具有很好的应用前景[8]。近几年，利用荧光量子点标记蛋白质分子研究其作用机理已有报道[9]，但是用该生物探针测定蛋白质的含量报道较少。本实验以六偏磷酸钠为稳定剂，巯基乙酸为修饰剂水相合成了荧光试剂CdS量子点，研究表明，牛血清白蛋白可使CdS的荧光峰增强，而阳离子表面活性剂CTMAB的加入，可使体系荧光峰显著增敏，并且荧光强度（F）与BSA浓度在一定范围内有良好的线性关系。据此，建立了CTMAB荧光增敏测定蛋白质含量的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛋白质储备液（10mg/mL） 取牛血清白蛋白（BSA，国药集团化学试剂有限公司，生化试剂，≥98%）1g，用水稀释定容至100mL；B-R缓冲溶液 取浓度均为0.04mol/L的硼酸、磷酸、醋酸混合溶液，用0.2mol/L的NaOH调至所需pH；硼酸-硼砂缓冲溶液 取0.2mol/L的硼酸和0.05mol/L的硼砂混合调至所需pH；十六烷基三甲基溴化铵（1.10mol/L）、巯基乙酸（0.10mol/L）、六偏磷酸钠（0.10mol/L）、CdCl2（0.10mol/L）、Na2S（0.10mol/L） 所用试剂均为分析纯；实验用水 二次蒸馏水。

F-7000荧光光度计 日本日立Hitachi公司；Labtech-1000紫外-可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司；pHS-3CT型酸度计 上海大普仪器有限公司；CL-4型恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 CdS量子点的制备

在80mL的烧杯中，依次加入蒸馏水50mL、CdCl22mL、六偏磷酸钠3mL、巯基乙酸5mL，用NaOH溶液调节pH到7.0。在搅拌的作用下，缓慢加入Na2S 3mL，反应2h，得到一定粒径大小的CdS。

1.3 实验方法

在10mL容量瓶中，加入3.0mL CdS溶液、2.5mL B-R缓冲溶液、含适量BSA的溶液，CTMAB 1.8mL，蒸馏水稀释至刻度，摇匀。于15℃反应25min，在Ex 370nm，Em 530nm处进行荧光测定。

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

激发光谱为370nm，分别对CdS、BSA、CdS-BSA体系及含不同量CTMAB的CdS-BSA-CTMAB体系进行荧光扫描，荧光光谱见图1。可以看出，CdS在发射光谱530nm处有最大吸收峰，BSA本身在此波长处无吸收，二者作用后使CdS-BSA复合物的荧光强度增强，而CTMAB的加入，可使体系荧光强度增敏显著。体系的荧光强度随BSA浓度的增大逐渐增强，并且在一定范围内与BSA浓度呈现良好的线性关系。

图1 荧光光谱Fig.1 Fluorescence emission spectra

2.2 pH的影响、缓冲体系及用量的选择

图2 酸度的影响Fig.2 Effect of acidity

配制一系列不同pH的B-R缓冲溶液，按照实验方法，测定不同酸度下的荧光强度F，以F对不同酸度（pH）作图（图2）。实验表明，当体系的pH在2.0～8.0范围内，体系F随pH的增大逐渐增大，且在pH为8.50时F达到最大，实验选择pH为8.50的缓冲溶液。实验对硼酸-硼砂、NH3-NH4Cl及B-R缓冲溶液进行选择，表明pH为8.50的硼酸-硼砂缓冲溶液使体系荧光强度增加显著。进一步对pH8.50的硼酸-硼砂缓冲溶液的用量进行选择，见图3。缓冲溶液用量在0～2.0mL范围内，F随着缓冲溶液用量的增大逐渐增加，且在2.0mL后体系荧光强度趋于稳定，实验选择pH8.50的硼酸-硼砂缓冲溶液2.5mL。

图3 缓冲溶液用量的影响Fig.3 Effect of buffer volume

2.3 CdS用量的影响

按照实验方法，固定其他条件不变，测定体系在CdS不同用量时的荧光强度，见图4。实验表明，随着CdS用量的增多，体系荧光强度逐渐增大，且在3.0mL以后趋于稳定，实验选择CdS的用量为3.5mL。

图4 CdS用量的影响Fig.4 Effect of CdS volume

2.4 CTMAB溶液用量的选择

按照实验方法，固定其他条件不变，测定体系在CTMAB不同用量时的荧光强度，见图5。实验表明，CTMAB用量在0～0.8mL范围内，随着用量的增多体系的荧光强度逐渐增大，且在0.8～1.8mL体系荧光强度趋于稳定，大于1.8mL后荧光强度逐渐降低，实验选择CTMAB的用量为1.5mL。

图5 CTMAB用量的影响Fig.5 Effect of CTMAB volume

2.5 反应温度和时间的影响

用温度控制仪调节水温，在10～70℃温度范围内分别测定温度对体系的影响，见图6。结果表明，10～25℃体系的荧光强度趋于稳定，随着温度的继续升高，F逐渐降低。实验选择温度为15℃，测定反应时间对体系的影响，见图7。实验表明，反应刚开始时，体系荧光强度不稳定，20min后，荧光强度趋于稳定，因此选定反应时间为20min。

表1 样品中BSA的测定结果Table 1 Determination results of BSA samples

表2 加标回收实验Table 2 Recovery test

图6 反应温度的影响Fig.6 Effect of temperature

图7 时间的影响Fig.7 Effect of time

2.6 工作曲线

按照实验方法，加入不同量的BSA，测定体系的荧光强度，以荧光强度F对BSA浓度C作图，如图8所示。实验表明，F与BSA浓度在8.0×10-5～1.3mg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为F=1487+937.7C（mg/mL），相关系数R=0.9957，检出限为7.4×10-5mg/mL。

2.7 共存离子的干扰

考察了常见的金属离子及多种氨基酸对含有0.02mg/mL BSA体系的影响，结果表明，在±5%误差允许范围内，500倍的NaCl、CaCl2、KCl、尿素、蔗糖、BaCl2，250倍的甘氨酸、L-谷氨酸、MgCl2，对实验均没有影响，同浓度的Zn2+、Cu2+、Pb2+、Al3+、Fe3+有明显的干扰，可加入不同的掩蔽剂进行消除。

图8 标准曲线Fig.8 Standard curv

2.8 样品测定及对照实验

取新磨好的豆浆（不加热）200mL，肉松13.8044g，分别加水稀释并定容至100mL，超声振荡3h，使样品中蛋白质充分溶解，用乙醚萃取三次，除去脂肪，过滤。即为待测液，备用。取样品测试液，按照实验方法测定，并与考马斯亮蓝法做对照，结果见表1。

2.9 加标回收实验

吸取一定量的样品测试液，分别加入一定量的BSA标准溶液，按照实验方法做加标回收实验。结果见表2。

3 结论

利用表面活性剂对CdS-BSA体系有增敏的作用，采用荧光法测定样品中蛋白质的含量。该方法准确、简单、快速、线性范围宽，通过测定样品并与标准方法做对照，结果满意，可用于食品中蛋白质含量的测定。

[1]大连轻工业学院，华南理工大学，郑州轻工业学院.食品分析[M].第一版.北京：中国轻工业出版社，2009：214-216.析[M].第一版.北京：中国轻工业出版社，2009：214-216.

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[8]陈伟，沈鹤柏，陈燕.新型荧光物质-量子点在生命科学领域的应用研究进展[J].化学通报，2007（6）：403-408.

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Determination of protein in food by CdS-BSA-CTMAB fluorometry

JIAO Man，DONG Xue-zhi*，HU Wei-ping，WANG Xin
（Henan University，Institute of Environmental and Analytical Sciences，College of Chemistry and Chemical Engineering，Kaifeng 475004，China）

CdS quantum dots（QDs）which had special spectral properties were prepared with sodium hexametaphosphate as stabilizer and mercapto-acetic acid as modifier by hydrothermal synthesis method.The results showed that the fluorescence intensity increasing after CdS reacted with novine serum albumin（BSA），but joined cetyltrimethy lammonium bromide（CTMAB）into system，the fluorescence increasing sensitivity.And the fluorescence intensity of system had a good linear relationship with the concentration of BSA in the range of 8.0×10-5～1.3mg/mL，and the linear equation was F=1486.94793+937.70328C，relation coefficient（R）was 0.9957，the limit of detection was 7.4×10-5mg/mL.The method have been used for determination of protein in food，and compared with the standard method（Coomassie brilliant blue method），the results were satisfactory.

CdS quantum dots；cetyltrimethy lammonium bromide（CTMAB）；bovine serum albumin（BSA）

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0334-04

2010-05-26 *通讯联系人

焦嫚（1985-），女，硕士，研究方向：食品与药物分析。

国家自然科学基金资助项目（20875022）；省部共建河南大学科研项目。