卷心菜中叶黄素提取工艺研究

谢 翎，陈红梅，杨吉彬，黄 勃

（1.安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆246011；2.安徽农业大学微生物防治省重点实验室，安徽合肥230036；3.安庆龙麟农业生态博览园发展有限公司，安徽安庆246003）

卷心菜中叶黄素提取工艺研究

谢 翎1，2，陈红梅1，杨吉彬3，黄 勃2，*

（1.安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆246011；2.安徽农业大学微生物防治省重点实验室，安徽合肥230036；3.安庆龙麟农业生态博览园发展有限公司，安徽安庆246003）

采用超声波辅助提取卷心菜中的叶黄素，高效液相色谱法检测叶黄素含量。在单因素实验的基础，通过正交实验确定卷心菜中叶黄素的最优工艺条件为：丙酮为提取剂，超声波功率为500W，超声提取时间为30min，料液比为1∶30，提取温度为60℃。卷心菜干粉中叶黄素含量约为5.6mg/100g。研究结果对叶黄素的生产与商业化应用将具有重要意义。

卷心菜，高效液相色谱法，叶黄素，超声波

图1 全反式异构体叶黄素分子结构图Fig.1 The structure of trans isomer lutein

叶黄素（lutein）是一种天然色素，又称植物黄体素，属于“类胡萝卜素”类物质，最早是由Wihelm与Wackenroder两位科学家于1831年发现的[1]。叶黄素分子量为568.9，其分子碳架，主要由两个六元环和一个多聚烯链共同组成。虽然，在理论上叶黄素有多种同分异构体，但自然条件下叶黄素主要还是以全反式异构体的形式存在[2]（图1）。由于具有色泽鲜艳、着色力强、安全无毒、富含营养等特点，叶黄素越来越受到人们的重视，从而在食品、保健品及医药领域被广泛的应用。随着对叶黄素相关研究的不断深入，人们发现叶黄素其实是一种优良的抗氧化剂[3]，在预防年龄相关性视黄斑退化[4-5]，降低结肠癌发病率[6]，预防心血管疾病的发生等方面有着显著的效果。目前，国际上对叶黄素的需求量日益增大，价格不断提升。因此，研究开发新的具有潜力的叶黄素植物源具有重要的商业价值。卷心菜（Brassica oleracea L.var. capitata L.），又名球甘蓝，属于甘蓝的变种，我国各地都有栽培。卷心菜口味清香，脆嫩，四季都能吃到，是主要的蔬菜品种之一。近年，西方一些国家的学者们发现它在抗衰老和防止心脑血管疾病、癌症等方面显现了奇异功效[7]。卷心菜在我国的产量非常高，且价格较低。通过卷心菜来提取叶黄素是一种非常理想的选择。本研究就是在前人工作的基础上，探索和优化卷心菜叶黄素提取工艺。由于常规叶黄素提取都是通过皂化方法，工艺较为复杂；本文采用超声波辅助有机溶剂提取卷心菜中叶黄素，旨在获得卷心菜中叶黄素的高效能提取法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

卷心菜 购于本地农贸市场，叶片洗净后切碎，经24h冻干后粉碎，卷心菜干粉用于后续叶黄素提取（卷心菜干粉可过50目筛）；叶黄素标样 德国Sigma公司；丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿 均为国产分析纯；甲醇 国产色谱纯。

Waters600高效液相色谱仪、分析型色谱柱（5μm，4.6×250mm，ODS2） 美国Waters公司；FreeZone12冷冻干燥系统 美国Labconco公司；SENCO R-502旋转蒸发仪 上海申胜生物技术公司；KH5200DB超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取液的确定 由于叶黄素易溶于二氯化碳、氯仿以及酯类。因此选取二氯化碳、氯仿、乙酸乙酯，以及常用有机试剂丙酮作为候选萃取液，以筛选合理的叶黄素提取溶剂。

精确称量5.0g卷心菜干粉，分别用二氯化碳、氯仿、乙酸乙酯以及丙酮定容至100mL，在超声波清洗器中400W功率下振荡60min（振动处理温度50℃）。振荡结束后，对样品在5000×g下离心5min。将澄清提取液旋转蒸干后，统一用丙酮定容至10mL。样品再次在5000×g下离心5min，进HPLC检测。另外，用丙酮分别配制叶黄素标准样品溶液5、10、20、50、100μg/mL。

1.2.2 超声波振动功率的确定 称取卷心菜干粉5.0g，用丙酮定容至100mL，分别在200、300、400、500、600W功率的超声波下振动60min（振动处理温度50℃）。振荡结束后，对样品离心。将澄清提取液浓缩后，用丙酮定容至10mL。样品再次离心后，进HPLC检测。

1.2.3 超声波振动时间的确定 称取卷心菜干粉5.0g，用丙酮定容至100mL，50℃下分别在超声波500W下振动10、30、60、90、120min（振动处理温度50℃）。振荡结束后，对样品离心。将澄清提取液浓缩后，用丙酮定容至10mL。样品再次离心后，进HPLC检测。

1.2.4 料液比的确定 称取卷心菜干粉5.0g，分别用25、50、100、150、200mL丙酮定容，50℃下在超声波500W下振动30min（振动处理温度50℃）。振荡结束后，对样品离心。将澄清提取液浓缩后，用丙酮定容至10mL。样品再次离心后，进HPLC检测。

1.2.5 超声波处理温度的确定 称取卷心菜干粉5.0g，用150mL丙酮定容，分别于40、50、60、70℃用超声波500W功率振动30min。振荡结束后，对样品离心。将澄清提取液浓缩后，用丙酮定容至10mL。样品再次离心后，进HPLC检测。

1.2.6 液相色谱条件 Waters高效液相色谱仪，检测波长446nm，色谱柱ODS2反向C18柱，柱温25℃，色谱时间20min，平衡时间5min，流动相为纯甲醇（流速0.5mL/min），进样量20μL。所有样品检测处理，均重复三次。

1.2.7 统计学处理 HPLC峰面积表达结果为平均值±标准差，使用DUCAN多重比较法[8]进行多个均数间两两比较。数据分析均使用DPS数据处理系统软件[9]。

1.2.8 正交实验设计 在单因素实验基础上，继续选择超声波处理功率、处理时间、处理温度及料液比为考察因素，以叶黄素HPLC检测出峰面积为指标，采用L9（34）正交实验（见表1），优化出卷心菜中叶黄素提取的最佳工艺参数。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

通过叶黄素标样进HPLC所得峰面积，在浓度5～100μg/mL范围内，以叶黄素浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到回归方程：y=548.4x+711.76，R2=0.9992。通过各处理样品与标样出峰时间对比，可以确定在4min左右所出峰为同一物质，即叶黄素。将各样品峰面积代入上述回归方程，即可获得卷心菜干粉中叶黄素含量。

2.2 单因素实验

2.2.1 提取试剂的确定 从表2可以看出，用丙酮作为提取溶剂提取的叶黄素量最多，其次为二氯甲烷和氯仿，乙酸乙酯提取量最低，且差异极显著。

表2 不同溶剂处理对卷心菜中叶黄素提取量的影响Table 2 Effect of solvents on extraction yield of lutein from cabbage

2.2.2 超声波振动功率的确定 选择丙酮作为提取溶剂，在不同的超声波功率处理下振荡60min。从表3可以看出，随着超声波振动功率的上升，在60min内叶黄素的出峰面积呈现明显的波动。200W时，叶黄素的出峰面积最小，只有7537.48mAU。当超声功率升到500W，峰面积达到最大值，为13573mAU。当超声波功率超过500W继续上升时，叶黄素的出峰面积开始降低。方差分析表明，各处理出峰面积差异极显著。

2.2.3 超声波振动时间的确定 选择丙酮作为提取溶剂，在500W超声波功率处理下振荡不同时间。从表4可以看出，超声处理30min时，叶黄素的出峰面积保持在最大值13536mAU。方差分析表明，超声处理30min与60min峰面积差异不明显。另外，当超声处理超过60min后，叶黄素的出峰面积明显开始下降。当振荡2h后，叶黄素的出峰面积下降至12182mAU。

表3 不同功率的超声振荡对卷心菜中叶黄素提取量的影响Table 3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of lutein from cabbage

表4 不同时间超声处理对卷心菜中叶黄素提取量的影响Table 4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of lutein from cabbage

2.2.4 料液比的确定 选择不同体积的丙酮作为提取溶剂，取5g冻干卷心菜粉，在500W超声波功率处理下振荡30min。从表5可以看出，5g干粉选用150mL丙酮抽提时（即料液比为1∶30），其平均叶黄素出峰面积最大，为15226mAU。方差分析表明，料液比为1∶30与1∶40时叶黄素出峰面积差异极不明显，说明继续增加溶剂量可能已无法提高叶黄素的抽提效率。

表5 不同料液比处理对卷心菜中叶黄素提取量的影响Table 5 Effect of solid to liquid ratio on extraction yield of lutein from cabbage

表6 不同温度处理对卷心菜中叶黄素提取量的影响Table 6 Effect of temperature during ultrasonic on extraction yield of lutein from cabbage

2.2.5 超声处理温度的确定 选择150mL的丙酮作为提取溶剂，取5g冻干卷心菜粉，在500W超声波功率处理下，于不同温度下用超声波500W功率振荡30min。从表6可以看出，方差分析说明50℃与60℃下处理时，峰面积数据差异并不明显。但60℃下抽提时，其平均叶黄素峰面积与叶黄素提取平均值都高于50℃处理。因此，后续正交实验应对温度处理条件进行进一步的优化。

2.3 正交实验优化

单因素实验表明，当提取试剂为丙酮时，超声振动功率、超声振动时间、料液比、处理温度对卷心菜干粉中叶黄素的提取量都具有影响。为寻求最佳工艺，在单因素实验的基础上设计正交实验，选取超声振动功率、振动时间、料液比和处理温度为考察因素，以叶黄素提取量为指标，取三水平按L9（34）设计正交实验。

表7表明，极差RB＞RC＞RD＞RA。极差越大，该因素水平变动时，单位材料中叶黄素提取量变化越大。即因素B（超声作用时间）对叶黄素提取量影响最大，其次是因素C（料液比），因素D（提取温度）次之，因素A（超声功率）对提取量影响最小。

表7 卷心菜叶黄素提取正交实验设计及结果Table 7 Orthogonal array matrix and experimental results

以叶黄素提取量为指标，进行方差分析。表8方差分析显示，FA＜FD＜FC＜FB＜F0.05=4.460，说明本实验选取各因素对叶黄素提取量的影响均表现为不显著。

表8 正交实验方差分析结果Table 8 Variance analysis for extraction yield of lutein with various extraction conditions

结合表7与表8可以得出，采用丙酮为提取试剂，卷心菜干粉中叶黄素的最佳提取工艺条件为超声功率500W，超声处理时间30min，料液比1∶30，处理温度60℃。在此条件下进行验证，卷心菜干粉中叶黄素含量约为：5.6mg/100g。

3 讨论与结论

叶黄素是自然界中一种重要生物活性物质，它在食品与保健品生产领域具有重要的作用。能够从低价的食物源原料中，通过简单易行的方法提取叶黄素，并进行精确定量定性分析，是目前叶黄素产业化研究的热点。本研究以国内产量巨大且价格偏低的常见蔬菜－卷心菜为材料，探索了叶黄素经济可行的新的提取方法和原料来源。

对于叶黄素的分析和检测，国内外之前已经有很多的方法，例如：薄层层析法（TLC）、分光光度法等[10]。由于TLC分析效果较差，且无法对产物精确定量。而分光光度法则对单一叶黄素测定结果会产生一定偏差[11]。因此，人们迫切希望能探索出精确分析叶黄素的新方法。近些年来，发展起来的HPLC就是一种精确的物质分析技术。由于其试剂消耗少、样品预处理简单，因此在植物组织活性物质分离分析方面具有独特优势[12-13]。所以，HPLC技术也是目前叶黄素提取工艺研究中较为理想的产物分析方法[14-15]。

我们通过有机试剂的直接强化提取，并借助超声波处理，简化了常规的叶黄素皂化提取分离工艺。结果表明，通过丙酮萃取抽提，在优化了超声波处理等条件后，卷心菜中的叶黄素能够高效率的被提取出来。每100g卷心菜干粉中，能获得5.6mg左右的叶黄素。

从研究结果中，我们也发现超声波的生物学效应十分复杂，不同的作用条件下其生物学作用是不同的。虽然理论上，提取时间越长，样品破碎越充分，则细胞中内含物被抽提的效率将会越高。但我们的实验结果表明，在超声波萃取叶黄素的过程中，在抽提一定时限后，即可将绝大多数水溶性成分提出。过多地延长提取时间，不仅破碎效率不会相应提高，甚至会对已生成的产物有破坏作用。另外，料液比合适时也可以提高叶黄素的产量，并减少不必要的浪费。

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Study on extraction technology of lutein from cabbage

XIE Ling1，2，CHENG Hong-mei1，YANG Ji-bin3，HUANG Bo2，*
（1.School of Life Science，Anqing Teachers College，Anqing 246011，China；2.Anhui Provincial Key Laboratory for Microbial Pest Control，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；3.Anqing Long Ling Agro-ecological Exposition Development Co.，Ltd.，Anqing 246003，China）

Lutein from cabbage was extracted by ultrasonic，and the production was determined by HPLC.The extraction process was optimized by the orthogonal-array-design on the basis of a series of single-factor experiments.Experimental results showed that the optimal condition was as follows：acetone as extraction solvent，the power of ultrasonic 500W，treatment time of ultrasonic 30min，the extraction ratio of solid to liquid 1∶30，extraction temperature 60℃.Under the optimum conditions，about 5.6mg lutein could be extracted from 100g dried powder of cabbage.This experimental conclusion had great significance for production and commercial application of lutein.

cabbage；high performance liquid chromatography；lutein；ultrasonic

TS255.1

B

1002-0306（2012）03-0269-04

2011－10－17 *通讯联系人

谢翎（1980-），男，讲师，博士，研究方向：生物化学与分子生物学。

安徽省高校省级自然科学项目（KJ2010B091）；安庆市重点科技项目（20100808）；安庆师范学院科研启动项目（044-K05000000281）。