皱纹盘鲍内脏β-1,3-葡聚糖酶的提取及其酶学性质研究

宫国君，朱蓓薇，杨静峰，米云龙

（大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

皱纹盘鲍内脏β-1,3-葡聚糖酶的提取及其酶学性质研究

宫国君，朱蓓薇，杨静峰*，米云龙

（大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

从鲍鱼内脏提取β-1，3-葡聚糖酶粗酶并研究其酶学性质。以昆布多糖为底物监控酶的活性。鲍鱼内脏经匀浆后，采用3倍体积0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）浸提12h。浸提液经离心后收集上清液，并采用60%饱和度的硫酸铵对上清液中的蛋白进行盐析沉淀得β-1，3-葡聚糖酶粗酶。研究表明，粗酶中β-1，3-葡聚糖酶的最适反应温度为40℃，酶活力在40℃以下稳定；酶的最适pH为6.0，酶活力在pH4.0～7.0范围内稳定。Mn2+能明显激活酶活力，而Cu2+、Fe3+、Hg+对酶活力有抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最强；亮肽酶素和1，10-菲啰啉对酶活力有明显的抑制作用，而E-64对酶活力有一定的激活作用；此酶对海藻酸钠也有一定水解能力。

鲍鱼，β-1，3-葡聚糖酶，酶学性质

β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.39）是一类能够特异性水解β-1，3糖苷键的水解酶。可用于饲料及啤酒工业[1-2]、增加多糖溶解性[3]、制备酵母原生质体[4]、植物病害防治等方面[5]。该酶广泛存在于微生物，如真菌[6]、细菌[7]、放线菌[8]等，植物如小麦[9]、青稞[10]、天麻[11]等和动物中。海洋中β-1，3-葡聚糖酶主要分布于海洋无脊椎动物。赵军岗等已从海参肠道中提取分离出此酶[12]，BACHMAN E S等对海参（Strongylocentrotus purpuratus）卵中的β-1，3-葡聚糖酶分子量等性质进行了研究[13]。另外Svetlana N等从扇贝（Mizuhopecten yessoensi）分离纯化出β-1，3-葡聚糖酶并研究了该酶基因的克隆与表达[14]。同样是海洋动物的鲍鱼是一种海洋单壳软体贝类，具有很高的经济价值和营养药用价值[15]。已有报道从鲍鱼体内提取分离褐藻胶裂解酶、淀粉酶及纤维素酶等消化酶[16-18]，而从鲍鱼的体内提取消化酶中的另一重要组成的β-1，3-葡聚糖酶，国内尚未见报道。本文以鲍鱼内脏为材料提取了鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖酶，并对其粗酶的酶学性质进行了研究和探讨，对于了解鲍鱼生理消化特性具有十分重要的意义，并为该酶的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲍鱼内脏 由大连獐子岛渔业集团提供；昆布多糖Laminarin、牛血清蛋白BSA、直链淀粉Amylose、支链淀粉Amylopectin Sigma公司；其他化学试剂 均为国产分析纯试剂。

UV2100型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；Z323K冷冻离心机 德国Hermle labortechnik。

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶的制备 称取20g的鲍鱼内脏加入3倍体积单位的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0，0.1mol/L），4℃下进行匀浆，低温静置12h后，冷冻离心（12000r/min，4℃）20min，上清液即为粗酶液，4℃保存备用。

1.2.2 酶活力测定 β-1，3-葡聚糖酶酶活力测定参照Wang等人[19]报道的方法，并略作改进称取8mg底物，加入10mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0，0.1mol/L）配成质量浓度为0.8mg/mL的底物储备液。取上述底物0.4mL，加入0.1mL酶液，于一定温度下反应30min，再加入0.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，于沸水浴显色反应5min，冷却后加入4mL蒸馏水稀释，540nm测定吸光光度值，以100℃水浴加热5min的酶液作为空白。酶活力单位（U）定义：在上述反应条件下，以每分钟水解底物释放出1μg还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位。

1.2.3 蛋白质含量的测定 蛋白质含量测定采用Lowry[20]法，以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白。

1.2.4 适宜硫酸铵饱和度的确定 取8份100mL的粗酶液，边搅拌边加入硫酸铵，使其饱和度分别达到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4℃静置12h，冷冻离心（12000r/min，4℃）10min，弃上清液，所得沉淀溶于10mL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0，0.1mol/L）中，同时测定上清液和沉淀中蛋白质含量及酶活力。

1.2.5 酶学性质的研究 最适反应pH的确定，分别用不同pH3.0～11.0的缓冲液配制成0.8mg/mL的底物然后加入酶液反应，测定酶活力。酸碱稳定性的确定，将酶液加入pH3.0～10.0的缓冲液，于4℃保持30min后，测定酶活力。最适反应温度的确定，酶液与底物溶液混合后，分别于10、20、30、40、50、60、70、80℃反应30min，反应前底物在各反应温度下预热5min，测定酶活力。金属离子对酶活力的影响，在酶与底物反应体系中，分别加入Fe3＋、Hg＋、Ni＋、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ba2+、K+，使其终浓度为1mmol/L，以不加金属离子的酶活作为100%，测定酶活力。抑制剂对酶活力的影响，在酶与底物反应体系中，分别加入亮肽酶素、PMSF、EDTA、E-64、DTT、碘乙酸、1，10-啡啰啉和抗痛素使其终浓度为0.1mmol/L，以不加抑制剂的酶活作为100%，测定酶活力。底物特异性的研究，分别配制0.8mg/mL的羧甲基纤维素钠、褐藻酸钠、直链淀粉、支链淀粉和昆布多糖，加入一定量的酶液反应，测定酶活力。

2 结果与讨论

2.1 鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖酶的提取

鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖酶的提取率约为84.5%，即20g鲍鱼内脏能提取出16.89g的β-1，3-葡聚糖粗酶，酶总活力为246.97U。

2.2 硫酸铵饱和度对提取效果的影响

硫酸铵饱和度对鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶活力的影响见图1。随着硫酸铵饱和度的增加，上清液中酶活力随着硫酸铵饱和度的增加逐渐降低，当饱和度达到80%时，上清液中酶活力为0。沉淀中β-1，3-葡聚糖酶活力均逐渐增加，当饱和度达到60%时酶收率最大，但当硫酸铵饱和度超过60%时，沉淀中酶活力反而下降，这主要是由于高饱和度的硫酸铵使酶蛋白部分失活造成[21]。因此，确定盐析提取β-1，3-葡聚糖酶的饱和度最优条件为60%。

图1 β-1，3-葡聚糖酶硫酸铵盐析图Fig.1 Salting out figure of β-1，3-glucanase

2.3 最适pH的确定

由图2可知，鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶在pH4.0～ 7.0范围内相对酶活力较高，当pH为6.0时相对酶活力最高，当pH大于6.0时，随着缓冲液pH的升高，相对酶活力逐渐降低，当pH大于10.0时，相对酶活力降到50%以下。该结果与Ana-Belén等研究来源于S.cerevisiae的β-1，3-葡聚糖酶，最适pH为6.0相一致[22]，但高于扇贝Mizuhopecten yessoensis中的β-1，3-葡聚糖酶的最适pH4.5[14]，说明该酶的最适pH与物种差异性有关。

图2 β-1，3-葡聚糖酶的最适pHFig.2 Profile of pH-dependent of β-1，3-glucanase

2.4 酸碱稳定性的确定

由图3可知，鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶在pH4.0～7.0范围内比较稳定，当酶处于pH3.0和pH9.0的环境中时，相对酶活力分别降低到40.73%和32.85%，说明鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶的稳定性与酶的最适pH的范围相符。有研究表明鲍鱼体内多种消化酶都在pH4.0～8.0范围内稳定[16，23-24]。

图3 pH对β-1，3-葡聚糖酶稳定性的影响Fig.3 Stability of pH-dependent of β-1，3-glucanase

2.5 最适温度的确定

由图4可知，鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶在30～ 50℃范围内酶活力较高，相对酶活力均在80%以上，其最适反应温度为40℃，大于50℃时酶活力开始下降，至70℃时相对酶活力降低到50%以下。鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶在较宽的温度范围内都有一定酶活力，这一性质将有利于酶的应用，特别是在细胞自溶和啤酒发酵中[25-26]。

图4 β-1，3-葡聚糖酶的最适温度Fig.4 Profile of temperature-dependent of β-1，3-glucanase

2.6 金属离子对酶活力的影响

表1 金属离子对β-1，3-葡聚糖酶活力的影响Table 1 Effect of differet metl ions on β-1，3-glucanase

由表1可知，10mmol/L和1mmol/L两个离子浓度下Cu2+、Mg2+、Zn2+、Hg+、Fe3+和Ni+对鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶有抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最强，Cu2+其次。Fe2+、Ba2+和K+对鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶酶活力影响不大。10mmol/L和1mmol/L的Mn2+均对鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶有激活作用，相对酶活力分别为276.5%和176.1%。金属离子对β-1，3-葡聚糖酶酶活力的影响，因酶的来源不同而存在差异。来源于木霉菌株LE02的β-1，3-葡聚糖酶被Mn2+强烈抑制[27]，而Mn2+却能激活来源于海参的β-1，3-葡聚糖酶[12]。吴琪等人研究发现Fe3+对β-葡聚糖酶活力的影响不大，而唐治玉等人研究发现Fe3+对里氏木霉所产生的β-葡聚糖酶有强烈的抑制作用[27]。

2.7 抑制剂对酶活力的影响

实验结果表明，在所选择的抑制剂，即PMSF、EDTA、1，10-啡啰啉、E-64和亮肽酶素，其中只有E-64对鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶有激活作用，相对酶活力达164.02%，EDTA、亮肽酶素和1，10-啡啰啉对酶的抑制作用不明显，相对酶活力分别为95.37%、86.29%和88.86%。巯基抑制剂E-64对该酶无抑制作用反而能增加酶活力，可能是由于E-64抑制了酶液中的蛋白酶类（这些含巯基蛋白酶类会占据底物的结合位点，阻碍β-1，3-葡聚糖酶与底物结合），进而间接地激活了β-1，3-葡聚糖酶[28]。

2.8 底物特异性的研究

由表2可知，鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶对昆布多糖的水解能力最强，比活力可达1.85U/mg。该酶同时对褐藻酸钠支链淀粉有一定水解能力，但是对羧甲基纤维素钠和直链淀粉几乎不能降解。这说明该酶对β-1，3糖苷键有很强的专一性，同时对α-1，4糖苷键也有一定水解作用。鲍鱼主要以海带为食，而其中的能量物质即为β-1，3糖苷键连接的多糖，所以说鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖酶是鲍鱼能量代谢中的重要酶类之一[29]。

表2 β-1，3-葡聚糖酶的底物特异性Tab 2 Substrate specificity of β-1，3-glucanase

3 结论

用pH6.0，0.1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液提取的鲍鱼内脏β-1，3-葡聚糖粗酶，最佳提取条件：60%硫酸铵盐析，其最适反应温度为40℃，酶的最适pH为6.0，酶活力在pH4.0～7.0范围内稳定。Mn2+能明显激活酶活力，而Cu2+、Fe3+、Hg+对酶活力有抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最强。亮肽酶素和1，10-菲啰啉对酶活力有明显的抑制作用，而E-64对酶活力有一定的激活作用，此酶对β-1，3糖苷键有很强的专一性。

[1]P Campbell，J Braam，Plant J.Crystal structures and properties of denovo circularly permuted 1，3-1，4-Gulcanase[J].J Sci Food Agr，1998，15：553-561.

[2]陈茂彬，钟晓凌.β-葡聚糖对大麦加工的影响和β-葡聚糖酶的应用[J].食品研究与开发，1999，20（3）：25-27.

[3]刘雨田，郭中文.β-葡聚糖和β-葡聚糖酶[J].畜禽业，2000（7）：42-43.

[4]Monteiro V N，Ulhoa C J.Biochemical characterization of a β-l，3-gIueanase Trochoderma.Koningi Induced by cell wall of Rhizoctonia solani[J].Current Microbiology，2006，52（2）：92-96.

[5]Ganapathi Sridevi，Chidambaram Parameswari，Natarajan Sabapathi.Combined expression of chitinase and β-1，3-glucanase genes in indica rice（Oryza sativa L.）enhances resistance against Rhizoctonia solani[J].Plant Science，2008，175：283-290.

[6]Delacruz J，Pintor-toroj A，Benitez T，et al.A novel endo-β-1，3-glucanase，BGN13.1，involved in the mycoparasitism of Trichoderna harzianum[J].J Bacteriol，1995，17（7）：6937-6945.

[7]Hong TY，Meng M.Biochemical characterization and antifungal activity of an endo-l，3-β-glucase of Paenibacillussp.Isolated from garden soil[J].Applied Microbi ology and Biotec hnology，2003，61（5-6）：472-478.

[8]Svnvijayendra，Yutaka Kashiwagi.Characterization of a new acid stable exo-β-1，3-Glucanase of Rhizoctonia solani and its action on microbial polysaccharides[J].Int J Biol Macromol，2009，44：92-97.

[9]孙斌，李多川，慈晓燕，等.小麦叶片β-1，3-葡聚糖酶的诱导、纯化与抗菌活性[J].植物生理与分子生物学学报，2004，30（4）：399-404.

[10]丁平，杜林方，张年辉.青稞中β-1，3-葡聚糖酶的纯化及部分性质研究[J].天然产物研究与开发，2003，15（4）：284-288.

[11]杨增明，胡忠.天麻球茎几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的初步研究[J].云南植物研究，1990，12（4）：421-426.

[12]赵军岗，董秀萍，朱蓓薇，等.海参肠道β-1，3-葡聚糖酶的提取条件及其酶学性质[J].大连轻工业学院学报，2007，26（4）：289-293.

[13]Bachman E S，Mccla Y D R.Molecular cloning of the first metazoan beta-1，3 glucanase from eggs of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：6808-6813.

[14]Svetlana N Kovalchuk，ElenV Sundukova，et al.Purification，cDNA cloning and homology modeling of endo-1，3-β-D-glucanase from scallop Mizuhopecten yessoensis[J].Comp Biochem PhysB，2006，143（4）：473-485.

[15]李韬，周大勇，杨静峰，等.皱纹盘鲍性腺多糖抗氧化活性研究[J].水产科学，2009，28（4）：179-182.

[16]Harumasa Suzuki，Ken-ichi Suzuki，AkiraInoue，et al.A novel oligoalginate lyase from abalone，Haliotis discus hannai，that releases disaccharide from alginate polymer in an exolytic manner [J].Carbohydr Res，2006，341：1809-1819.

[17]杨蕙萍，童圣英，王子.皱纹盘鲍淀粉酶和褐藻酸酶的研究[J].水产学报，1998，22（4）：345-351.

[18]吴永沛，何碧烟.九孔鲍褐藻酸酶、琼脂酶及纤维素酶的提取纯化[J].海洋科学，2002，26（3）：4-7.

[19]Wang GJ，Peil IN X，Geoffieyb，et al.Purification，characterization and genest ructure of 1，3-β-glucanase isoenzyme G from barley（Hordeum vulgare）[J].Eur J Biochem，1992，209：103-109.

[20]Lowry O H，Rosebrou GH N J，Farr A L，et al.Protein measurement with the Folin phehol reagent[J].Biol Chem，1951，193：265-275.

[21]Ching-yu TSAO，Yun-zu PAN，Shann-tzong JIANG，et al. Purification and Characterization ofAmylases from Small Abalone（Sulculus diversicolor aquatilis）[J].J Agric Food Chem，2003，51：1064-1070.

[22]Ana-Bele’n，Martı’n-Cuadrado，ThierryFontaine，et al. Characterization of the endo-β-1，3-gluca-nase activity of Scerevisiae Eng2 and other members of the GH81family[J]. Fungal Genet Biol，2008，45：542-553.

[23]Chingyu Tsao，Yunzu Pan，Shannntzong Jiang.Purification and Characterization of Amylases from Small Abalone（Sulculus diversicolor aquatilis）[J].J Agric Food Chem，2003，51：1064-1070.

[24]Ken-ichi Suzuki，Takao Ojima，Kiyoyoshi Nishita.Purification and cDNA cloning of a cellulase from abalone Haliotis discus hannai[J].Eur J Biochem，2003，270：771-778.

[25]Fontaine T，Hartland R P，Beauvais A，et al.Purification and characterization of an endo-1，3-β-glucanase from Aspergillus fumigates[J].Eur J Biochem，1997，243：315-321.

[26]郑元平，袁康培，冯明光.啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化[J].农业生物技术学报，2004，12（3）：316-321.

[27]唐治玉，段会柯，熊善柏.木霉LE02 β-1，3-葡聚糖酶酶学特性的研究[J].食品与发酵工业，2007，33（5）：32-36.

[28]Aranishi F，Ogata H，ar K，et al.Purification and characterization of cathepsin L from Hepatopancreas of Carp Cyrinus carpio[J].Comp Biochem Phys A，1997，118（3）：531-537.

[29]Pang Z，Otaka K，Maoka T，et al.Structure of β-glucan oligomer from laminarin and its effect on human monocytes to inhibittheproliferationofU937cells[J].BiosciBiotechnolBiochem，2005，69：553-558.

Extraction and properties of β-1，3-glucanase from viscera of the abalone Haliotis discus hannai

GONG Guo-jun，ZHU Bei-wei，YANG Jing-feng*，MI Yun-long
（School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Extraction and partial properties of crude β-1，3-glucanase from viscera of the abalone Haliotis discus hannai were investigated.In the course of research，laminarin was used as a specific substrate to monitor the enzyme activity.Fresh abalone viscera were homogenized and mixed with three times volume of phosphate and citric acid buffer（pH6.0，0.1mol/L）.Following extraction for 12h，the mixture was centrifuged. Proteins in the supernatant were precipitated with ammonium sulfate at the concentration of 60%saturation to get crude β-1，3-glucanase.The optimum activity temperature and pH of the crude enzyme were 40℃ and pH6.0.The enzyme activity appeared to be stable over pH4.0～7.0 and up to 40℃.The enzyme activity was activated significantly by Mn2+，Cu2+，Fe3+and Hg+could inhibit the enzyme activity，in which Fe3+was the strongest inhibitor.Leupeptin and 1，10-phenanthroline could inhibit the enzyme activity，but E-64 could enhance the enzyme activity.

abalone；β-1，3-glucanase；enzymatic properties

TS254.1

A

1002-0306（2012）03-0110-04

2010－12－28 *通讯联系人

宫国君（1984-），女，硕士研究生，研究方向：海洋生物化学与微生物学。

国家863高技术研究发展计划（2007AA091804）；“十一五”国家科技支撑计划（2008BAD94B07）。