纤维素酶-超声波辅助有机溶剂提取山葡萄渣中白藜芦醇的研究

钱时权，石亚中，伍亚华，李善菊，孙兰萍，许 晖

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030）

纤维素酶-超声波辅助有机溶剂提取山葡萄渣中白藜芦醇的研究

钱时权，石亚中，伍亚华，李善菊，孙兰萍，许 晖

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030）

为进一步提高山葡萄渣中白藜芦醇提取效率，研究了纤维素酶-超声波强化处理对山葡萄渣中白藜芦醇提取效果的影响。研究在单因素实验的基础上进行正交实验，分析纤维素酶酶解温度、超声波处理时间、料液比、提取时间对白藜芦醇含量的影响。结果表明：山葡萄渣中白藜芦醇提取的最佳提取工艺条件为：酶解温度55℃，超声处理时间5min，料液比1∶30，提取时间4h。在此条件下测得白藜芦醇的含量为1.187mg·g-1。纤维素酶和超声波复合处理提取工艺能更有效地提高山葡萄渣中白藜芦醇含量，此工艺优于纤维素酶、超声波单一因素处理提取工艺。

白藜芦醇，纤维素酶酶解，超声波处理，有机溶剂

白藜芦醇（Resveratro1，简称Res）是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物[1]，易溶于氯仿、甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂[2]。白藜芦醇是1940年日本人首次从毛叶藜芦（Veratrum grandiflorum，O.Loes）的根中获得的。研究发现白藜芦醇具有抗癌、心血管保护、抗氧化等多方面的药理作用[2-4]。白藜芦醇提取的方法主要有有机溶剂法、热水浸提法、超声波法、超临界萃取法、酶法等。纤维素酶能够水解纤维，使植物细胞壁破坏，充分释放细胞内含物，有利于对有效成分的提取。而超声波破碎能使生物活性物质充分溶出，应用超声技术来强化提取工艺，可有效提高提取效率[5-6]。葡萄中含有丰富的白藜芦醇，尤以葡萄皮和葡萄籽中为最多。本论文在前期研究[7]的基础上研究不同提取条件对山葡萄渣中的白藜芦醇提取效果的影响，然后在单因素实验的基础上，通过正交实验优化提取工艺条件，以期获得山葡萄渣白藜芦醇提取的最佳工艺参数，为进一步开发葡萄资源提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山葡萄渣粉末 将山葡萄皮、籽阴干，按1∶1（m/m）混合后粉碎过60目筛备用，购自蚌埠市农贸市场；白藜芦醇标准品，纯度98% 购自山东泓捷生物科技有限公司；纤维素酶，单位酶活力为500000U/g 河南省所以化工有限公司；无水乙醇、甲醇、丙酮 均为分析纯。

紫外分光光度计752型 上海光学仪器厂；超声波萃取仪 上海生析超声仪器有限公司；旋转蒸发仪 上海予华仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇的提取[8]用清水洗净山葡萄渣，晒干后粉碎，过60目筛备用。取粉末1g，放入150mL锥形瓶中，加入适量水和纤维素酶进行酶解，酶解后加入一定量体积分数为80%的乙醇和丙酮，在功率为400W的条件下超声波提取一段时间后，将提取液离心，经浓缩、蒸发得白藜芦醇样品。

1.2.2 白藜芦醇含量的测定[9]

1.2.2.1 白藜芦醇标准曲线的制作 称取适量白藜芦醇置于容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得白藜芦醇对照品储备液。精密吸取对照品储备液，配制成一系列不同浓度的标准溶液，于306nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，以对照品浓度（μg/mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标，得回归线性方程y=0.6942x-0.0315（R2=0.9942），线性范围为3.92～17.64μg/mL。从线性回归方程看出，白藜芦醇含量与吸光度值成正相关。

1.2.2.2 样品中白藜芦醇含量的测定 准确称取一定量样品于250mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品液，于306nm处测定吸光度值，由回归线性方程得出白藜芦醇含量。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 酶解温度对白藜芦醇含量的影响 取适量粉末，纤维素酶添加量为1.5mg·g-1，纤维素酶添加量具体确定方法见参考文献[8]，pH=5条件下，设置45～65℃，酶解1.5h。酶解后加入料液比为1∶35的体积分数为80%的乙醇和丙酮，先在功率为400W的条件下超声波处理6min，然后再在75℃条件下提取4.5h后，将提取液离心，经浓缩、蒸发得白藜芦醇样品。用甲醇溶解样品并稀释，摇匀，于306nm处测定吸光度值，由回归线性方程得出白藜芦醇含量。

1.2.3.2 超声波处理时间对白藜芦醇含量的影响 在功率为400W的条件下超声波处理3～7min，其他条件同1.2.3.1。分析超声波处理时间对白藜芦醇含量的影响。

1.2.3.3 料液比对白藜芦醇含量的影响 加入料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的体积分数为80%的乙醇和丙酮，其他条件同1.2.3.1。考察料液比对白藜芦醇含量的影响。

1.2.3.4 提取时间对白藜芦醇含量的影响 加入料液比为1∶35的体积分数为80%的乙醇和丙酮，提取2.5～4.5h。其他条件同1.2.3.1。探讨提取时间对白藜芦醇含量的影响。

1.2.3.5 提取温度对白藜芦醇含量的影响 加入料液比为1∶35的体积分数为80%的乙醇和丙酮，在65～85℃提取4.5h。其他条件同1.2.3.1。考察提取温度对白藜芦醇含量的影响。

1.2.4 正交实验 在单因素实验的基础上对影响白藜芦醇含量的主要因素，即酶解温度、超声波处理时间、料液比和提取时间，进行L9（34）正交实验，见表1。根据正交实验结果分析得出山葡萄渣中白藜芦醇提取的最佳条件。

表1 白藜芦醇提取工艺因素与水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 结果与分析

2.1 单因素对白藜芦醇含量的影响

2.1.1 酶解温度对白藜芦醇提取效果的影响 结果如图1所示，从图1可以看出，酶解温度在55℃时白藜芦醇的含量最高，但在55℃以后，温度升高，含量增加不明显。在酶解反应中，温度与酶稳定性和反应速度有关。当温度升高时，反应速度加快，有利于酶解的进行，但温度过高会使酶产生变性失活作用，影响酶与底物的结合，使反应速度降低。因此选择酶解温度为55℃。

图1 酶解温度对白藜芦醇提取效果的影响Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on resveratrol extraction

图2 超声波处理时间对白藜芦醇提取效果的影响Fig.2 Effect of ultrasonication time on resveratrol extraction

2.1.2 超声波处理时间对白藜芦醇提取效果的影响 结果如图2所示，由图2可知，超声波处理时间为4～5min时，白藜芦醇含量提高得最快，当超声波作用时间为5min时，白藜芦醇含量达到最大，超声波作用5min后，白藜芦醇含量开始慢慢降低，这可能是由于随着超声波处理时间的延长，白藜芦醇的稳定性会有所下降，导致白藜芦醇含量降低。2.1.3 料液比对白藜芦醇提取效果的影响 分别选用不同的料液比对葡萄渣中白黎芦醇进行提取，料液比对白黎芦醇含量的影响如图3所示。由图3可以看出，当料液比1∶20～1∶30时，白黎芦醇含量增加迅速，料液比为1∶30时，白黎芦醇含量达到最大，料液比超过1∶30后白藜芦醇含量增加很缓慢。结合实际综合考虑，选择料液比为1∶30较好。

图3 料液比对白藜芦醇提取效果的影响Fig.3 Effect of rate of solution to solid on resveratrol extraction

2.1.4 提取时间对白藜芦醇提取效果的影响 结果如图4所示，由图4不难看出，白藜芦醇含量随着提取时间的延长而增加，提取时间为4h时达到最大。当提取时间继续增加，白藜芦醇含量反而有所下降，这可能与白藜芦醇的热敏性较强有关，在较高温度下提取过长时间使得白藜芦醇发生分解，从而导致白藜芦醇含量下降。

图4 提取时间对白藜芦醇提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction time on resveratrol extraction

2.1.5 提取温度对白藜芦醇提取效果的影响 结果如图5所示，随着温度的升高，白藜芦醇含量先升后降，在60～75℃时白藜芦醇含量逐渐增加，75℃时达到最大，随后开始下降，白藜芦醇含量下降的原因是由于温度的增加破坏了白藜芦醇分子结构，使其构象发生改变，导致其提取效率下降。因此，选择75℃为白藜芦醇提取温度为宜。

图5 提取温度对白藜芦醇提取效果的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on resveratrol extraction

2.2 正交实验

根据以上单因素实验得到的结果，考虑各因素之间相互影响，选取酶解温度（A）、超声处理时间（B）、料液比（C）、提取时间（D）4因素进行L9（34）正交实验。山葡萄渣白藜芦醇提取条件的实验方案和正交实验结果如表2和表3所示。通过直观分析可知，影响因素的大小顺序为C＞D＞B＞A，即料液比＞提取时间＞超声处理时间＞酶解温度。方差分析表明料液比对山葡萄渣中白藜芦醇含量影响极显著，提取时间对山葡萄渣中白藜芦醇含量影响显著，其它两因素对白藜芦醇含量影响不显著。综合以上因素和实验结果，确定最佳提取工艺为A2B1C2D2，即酶解温度55℃，超声处理时间5min，料液比1∶30，提取时间4h。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiments

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

2.3 提取效果比较验证

在不同提取方法和工艺条件下提取山葡萄渣中白藜芦醇，结果见表4：方法4，即通过本论文正交实验获得的最佳提取工艺，提取得到白藜芦醇含量最高，达到1.187mg·g-1，其次是方法3，再次是方法2，而方法1的提取效果最不理想，白藜芦醇含量仅为0.660mg·g-1。由此不难看出，与方法1、方法2和方法3相比，方法4更能有效地提取山葡萄渣中的白藜芦醇。

3 结论

3.1 通过单因素实验和正交实验，得到山葡萄渣白藜芦醇提取的最佳提取工艺条件为：酶解温度55℃，超声处理时间5min，料液比1∶30，提取时间4h。在此条件下，白藜芦醇的含量为1.187mg·g-1。

3.2 通过比较验证，结果表明：经纤维素酶和超声波复合处理的提取工艺能更有效地提取山葡萄渣中白藜芦醇，该工艺优于纤维素酶、超声波单一因素处理提取工艺。

表4 不同提取条件对Res含量的比较Table 4 Comparison of different extraction conditions on content of Res

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Extraction of resveratrol from amur grape residue by cellulase enzymolysis and ultrasonication assisted organic solvent

QIAN Shi-quan，SHI Ya-zhong，WU Ya-hua，LI Shan-ju，SUN Lan-ping，XU Hui
（Department of Bioengineering and Food，Bengbu College，Bengbu 233030，China）

The paper discussed the impact of cellulase enzymolysis and ultrasonication on the extraction of resveratrol from amur grape residue，the research was investigated with the content of resveratrol as the guide and enzymolysis temperature，ultrasonication time，rate of solid to solution，and extraction time were analyzed. The extraction conditions based on single factor experiment were optimized by orthogonal design.The optimum extraction conditions were as follows：the cellulase enzymolysis temperature was 55℃，the ultrasonication time was 5min，the rate of solid to solution was 1∶30 and the extraction time was 4h.Under these optimized conditions，the content of resveratrol was finally determined to be 1.187mg·g-1.The technology combined with cellulase enzymolysis and ultrasonication was inclined to be more effective for improving the content of resveratrol，compared with the individual operation of cellulase enzymolysis and ultrasonication.

resveratrol；cellulase enzymolysis；ultrasonication；organic solvent

TS255.1

B

1002-0306（2012）03-0210-04

2011－04－06

钱时权（1979-），男，硕士，助教，主要从事天然产物开发与食品生物技术方面的研究。

蚌埠学院自然科学研究项目（2010ZR14）；安徽省高等学校省级食品科学与工程特色专业建设点（20101091）；安徽省食品科学与工程教学团队项目（20101094）；安徽省青年教师资助项目（2007jq1127）。