雪莲果粉对双歧杆菌的体外促生长作用研究

吴三林，刘 芳，贺 琴，刘 超，李书华

（乐山师范学院化学与生命科学院，四川乐山614000）

雪莲果粉对双歧杆菌的体外促生长作用研究

吴三林，刘 芳，贺 琴，刘 超，李书华

（乐山师范学院化学与生命科学院，四川乐山614000）

研究了雪莲果粉对3种双岐杆菌（长双歧杆菌、短双歧杆菌和两歧双歧杆菌）体外生长的影响。结果表明，雪莲果粉对3种双歧杆菌的体外生长均有显著的促进作用，优于葡萄糖作碳源时的生长效果，同时对不同的双歧杆菌的促进作用不完全一致。雪莲果粉浓度为1.6%～2.4%（m/v）时长双歧杆菌增殖效果最明显，0.8%～1.6%（m/v）时短双歧杆菌促生长效果明显，1.2%～2.4%（m/v）两歧双歧杆菌促生长效果明显。

雪莲果，双歧杆菌，低聚果糖，促生长

人体肠道内双歧杆菌数量的增多对维持人体身体健康十分重要。促使人体肠道内双歧杆菌数量增多的方法主要有两种：一种是直接口服双歧杆菌的微生态调节剂；另一种是服用能促进双歧杆菌在肠道内增殖的物质[1]。口服双歧杆菌活菌剂受到许多条件的限制，寻求间接促进双歧杆菌生长的方法和途径成为研究者关注的方向。由于双歧杆菌营养要求高，需要外源性生长因子，即双歧杆菌促生长因子（Bifidus factor，BF）[2]。BF是能够促进双歧杆菌生长繁殖的一大类天然及合成物质，通过促进双歧杆菌生长繁殖表现其主要的生理功能，如：提高人体免疫力，抑制肠道有害菌生长等[3]。目前报道的BF中低聚糖及糖基化类物质占主要部分。低聚糖（Oligosaccharide）又叫寡糖，它包括功能性低聚糖和普通低聚糖，其中功能性低聚糖不能被机体消化吸收，是公认的双歧杆菌增殖因子[4]。作为BF——低聚果糖高含量的健康食品，雪莲果越来越受人们的关注。雪莲果（Smallanthus sonchifolius），又叫亚贡（Yacon）[5]，属菊科（Compositae）向日葵属（Helianthus L.）[6]。雪莲果中含有丰富的低聚果糖，其低聚果糖含量为所有已知植物块茎中最高，被称为“低聚果糖之王”[6－8]。低聚糖占到雪莲果干物质的8.0%～61.9%[9]。低聚果糖不被人体利用，但能直接进入肠道被双歧杆菌吸收，帮助双歧杆菌在短时间内迅速地增长[9]。目前，对雪莲果的研究主要集中在其营养成分和食品加工方面，关于雪莲果粉对双歧杆菌的促生长作用，国内研究极少。本实验研究了不同浓度的雪莲果粉对三种双岐杆菌体外生长的影响情况，为雪莲果的开发和综合利用，促进肠道双歧杆菌数量增多的途径提供更多的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

雪莲果 乐山市水果市场，低聚糖含量占干物质的46%（用紫外分光光度法测出）；长双歧杆菌（B. longum）、短双歧杆菌（B.breve）、两歧双歧杆菌（B. bifidum） 广东省微生物菌种保藏中心；双歧杆菌基础培养基 参考郝林华[10]、Ryuichiro tanaka[11]的配方，加H2O定容至1L，pH7，116℃高压灭菌30min；双歧杆菌雪莲果培养基 在基础培养基的配制上略有变动，以不同剂量的雪莲果粉代替葡萄糖作为培养基中的碳源，添加量分别为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、4%（m/v）；双歧杆菌BS培养基[12－13]购买于青岛高科园海博生物技术有限公司，用于双歧杆菌的分离和计数。

DHG－9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海恒科学仪器有限公司；电热手提压力蒸汽消毒器 中国上海；KD723型可见分光光度计 上海科登精密仪器有限公司；YQX－Ⅱ厌氧培养箱 上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备雪莲果干粉 将雪莲果削皮，切成薄片，置于65℃干燥箱中烘干至恒重。将烘干的雪莲果研磨成粉末，放在干燥器中备用。

1.2.2 配制稀释液和培养基[14]。

1.2.3 雪莲果粉对双歧杆菌体外生长的影响 以雪莲果粉培养基作为实验组，基础培养基作为对照组。用移液枪取0.1mL双歧杆菌菌悬液置于分别含有雪莲果粉0.1%，0.2%，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%，2.4%，4.0%的5mL液体雪莲果粉培养基试管中，并以液体基础培养基作为对照。每一浓度设置3个重复，测定各培养液的吸光值OD550nm[10]和pH。用平板菌落计数法计数。观察3种菌菌落生长情况[10]。

1.2.4 双歧杆菌生长曲线的测定 通过上述实验，确定雪莲果粉作碳源在双歧杆菌培养基中的最适添加量（根据实验结果，选择1.6%的雪莲果粉浓度）。配制该雪莲果粉含量的液体培养基，灭菌备用。以长双歧杆菌为例，取7支装有5mL液体培养基的试管，分别接种1mL长双歧杆菌的菌悬液，37℃恒温厌氧培养。在相应的培养时间取出长双歧杆菌的培养液，立即测定，同时测定各管菌悬液的吸光值OD550nm。以培养时间为横坐标，双歧杆菌菌悬液在550nm的吸光值为纵坐标，绘制生长曲线。同时测定液体培养基pH的变化。短双歧杆菌和两歧双歧杆菌作相同的培养，测定生长曲线。每个处理设置3个重复，同时以双歧杆菌液体基础培养基作为对照组。

2 结果与讨论

2.1 雪莲果粉对双歧杆菌体外生长的促进作用

雪莲果粉对3种双歧杆菌体外生长的影响见表1，雪莲果粉培养基的3种双歧杆菌与基础培养基组相比，菌落数有不同程度的增加，说明雪莲果粉对双歧杆菌的体外生长有促进作用。同时，从表1的结果表明，培养基中雪莲果粉的含量并不是越高越好，不同双歧杆菌生长的雪莲果粉浓度不同。长双歧杆菌在雪莲果粉浓度为2.0%时生长效果最明显，菌落数达到10.5×108CFU/mL，是基础培养基的2.2倍。短双歧杆菌在雪莲果粉浓度为1.6%时增殖效果最明显，菌落数达到11.6×108CFU/mL，是基础培养基的1.9倍，浓度为4.0%时，短双歧杆菌的生长受到抑制，菌落数反而比基础培养基降低了5%，可能是高浓度的雪莲果粉使得细菌细胞脱水，抑制了它的生长。两歧双歧杆菌在1.6%的雪莲果粉浓度的培养基中增值效果最明显，菌落数达到12.8×108CFU/mL，是基础培养基的1.7倍，在浓度为4.0%时，菌落数比基础培养基组下降了10%，两歧双歧杆菌的生长受到了抑制。综合不同浓度的雪莲果粉培养基对3种双歧杆菌增殖效果，在1.6%的浓度时，增殖效果最明显，长双歧杆菌、短双歧杆菌和两歧双歧杆菌菌落数分为9.4×108CFU/mL，11.6×108CFU/mL和12.8×108CFU/mL，分别比基础培养基增加95.8%、93.3%和70.7%。

表1 雪莲果粉对双歧杆菌体外生长的影响Table 1 Effects of yacon powder on the growth of Bifidobacteria in vitro

2.2 双歧杆菌生长曲线的测定

图1 长双歧杆菌生长曲线Fig.1 Growth curve of B.longum

图2 短双歧杆菌生长曲线Fig.2 Growth curve of B.breve

3种双歧杆菌液体培养后的生长变化（见图1～图3），3种双歧杆菌在雪莲果粉培养基中的生长繁殖的速度均快于基础培养基中的增殖速度，表现为雪莲果粉液体培养基OD550nm值均大于基础培养基的，并且生长曲线表现为先升高，达到峰值后降低的变化趋势。雪莲果粉培养基组和基础培养基组均在经过很短的适应期后进入对数生长期，培养12h后，雪莲果粉培养基中的双歧杆菌增殖速度明显快于基础培养基，培养48h后，3种双歧杆菌的液体培养基的OD550nm值均达到最大，长双歧杆菌在雪莲果粉培养基的OD550nm值达1.67，而基础培养基中的OD550nm值只有1.125，比基础培养基增加48.4%。短双歧杆菌在雪莲果培养的OD550nm值达1.631，而基础培养基中的OD550nm值只有1.085，比基础培养基增加50.3%。两歧双歧杆菌，雪莲果粉培养基OD550nm值达1.424，而基础培养基中的OD550nm值只有1.118，比基础培养基增加27.4%。之后，双歧杆菌的生长开始变慢，逐步进入衰亡期，但从图中可见，雪莲果粉培养基中双歧杆菌进入衰亡期的速度比基础培养基慢。从3种双歧杆菌的生长曲线来看，在雪莲果粉培养基中，长双歧杆菌和短双歧杆菌在对数期的增殖速度较两歧双歧杆菌的增殖速度快，说明雪莲果粉对长双歧杆菌和短双歧杆菌的体外生长的促进作用较两歧双歧杆菌更明显。

从表2中可以看出，雪莲果培养基和基础培养基的pH变化基本一致，表现为pH由7一直下降的趋势。在培养12h时，雪莲果培养基的pH下降程度低于基础培养基，说明此时的雪莲果粉培养基，缓冲能力较强，可以延迟pH下降的程度。进入稳定期和衰亡期后，2种培养基的pH均下降到5.0左右。

图3 两歧双歧杆菌生长曲线Fig.3 Growth curve of B.bifidum

表2 3种双歧杆菌液体培养后的pH变化Table 2 pH changes of 3 kinds of Bifidobacteria in the liquid culture medium

3 结论

本实验通过用雪莲果粉来作为双歧杆菌体外生长的碳源，培养了长双歧杆菌，短双歧杆菌和两歧双歧杆菌，研究结果表明雪莲果粉对双歧杆菌体外生长有显著的促进作用，优于葡糖糖作为培养基碳源时的生长效果。培养基中雪莲果粉的添加量要适宜，同时不同双歧杆菌生长所需的雪莲果粉浓度不同。对长双歧杆菌，1.6%～2.4%为最适剂量；对短双歧杆菌，0.8%～1.6%为最适剂量；对两歧双歧杆菌，1.2%～2.4%为最适剂量；1.6%的浓度时，对3种菌的增殖效果都很明显。过高浓度的雪莲果粉对双歧杆菌的生长有抑制作用。过低的雪莲果粉浓度的促进效果不明显，无法满足双歧杆菌生长过程所需的营养。3种双歧杆菌的生长曲线表明，雪莲果粉在对数期能使细菌显著增殖，稳定期时菌体数量大大高于葡萄糖作为碳源的双歧杆菌数量。本实验的结果进一步说明，雪莲果粉能促进双歧杆菌的生长与快速增殖。

[1]张秋红，张香香，王文香.大豆低聚糖的生理功能及在食品中的应用[J].食品研究与开发，2005，26（4）：166－168.

[2]郑海涛，崔廷婷，王洋.雪莲果对双歧杆菌促生长作用的研究[J].中国乳业，2010（1）：50.

[3]涂国云，蒋寒青，康白.双歧杆菌促生长因子的研究[J].中国微生态学杂志，1996，8（6）：50－51.

[4]李平兰，江汉湖.双歧杆菌增殖因子－－－低聚糖的功能及在食品上的应用[J].中国微生态学杂志，1998，10（4）：239－241.

[5]武莹.雪莲果中糖类成分分析及低聚果糖制备工艺路线初探[D].北京：北京中医药大学，2008.

[6]陈燕，王文平，吴国卿，等.雪莲果乳酸菌饮料的研制[J].安徽农业科学，2009，37（30）：15071－15073.

[7]蒲海燕.雪莲果的综合利用与开发[J].河南工业大学学报：自然科学版，2010，31（3）：86－90.

[8]王照波，周文美，徐子婷，等.雪莲果水溶性低聚糖的提取工艺[J].贵州农业科学，2010，38（2）：173－176.

[9]熊伟，张健.低聚糖（FOS）——超强双歧因子[J].西部探矿工程，2006（12）：292－294.

[10]郝林华.牛蒡寡糖对双歧杆菌体外生长的促进作用[J].海洋科学发展，2005，23（3）：347－351.

[11]Ryuichiro tanaka，Masahiko mutai.Improved medium for selective isolation and enumeration of Bifidobacterium[J].Applied and Environmental Microbiology，1980，40（5）：886－869.

[12]陈晋安，刘蓉，郑忠辉，等.菊芋低聚果糖促进双歧杆菌生长的研究[J].厦门大学学报：自然科学版，2001，40（4）：968－972.

[13]熊德鑫.厌氧体菌分离和鉴定方法[M].南昌：江西科技出版社，1986：9－11.

[14]黄秀梨，辛明秀.微生物学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2008：53－60.

Study on the growth promoting effect of yacon powder on Bifidobacteria in vitro

WU San-lin，LIU Fang，HE Qin，LIU Chao，LI Shu-hua
（College of Chemistryamp;Life Sciences，Leshan Normal University，Leshan 614000，China）

In this experiment，yacon powder instead of glucose which could be used as acarbohydrate source in the culture medium.The growth of three Bifidobacteria：B.longum，B.breve，B.bifidum in vitro was studied.The results showed that yacon powder had significant effect to promote the growth of the three Bifidobacteria in vitro，the effect was better than that of glucose used as a carbohydrate source.Further more，promoting effect was different for different Bifidobacterium.The most significantly proliferation effect for B.longum，B.breve and B.bifidum were 1.6%～2.4%，0.8%～1.6%，1.2%～2.4%，respectively.

yacon；Bifidobacterium；smallanthus sonchifolius；fructo-oligosaccharide（FOS）growth promoting

TS201.3

A

1002－0306（2012）14－0176－03

2011－07－18

吴三林（1963－），男，本科，副教授，研究方向：植物生理生化。

四川省教育厅科研项目（10ZC018）。