血管生成素1，2通过诱导型一氧化氮合酶调节失血性休克大鼠血管低反应性＊

徐 竞 蓝 丹 李 涛 杨光明 刘良明

休克后血管反应性呈早期增高和晚期降低的双相变化［1］，其发生机制尚不清楚。本实验室前期研究发现，血管生成素－1（Angiopoietin－1，Ang－1）、血管生成素－2（Angiopoietin－2，Ang－2）在失血性休克后大鼠肠系膜上动脉（Superior Mesenteric Artery，SMA）中呈时间上的差异表达，并通过Tie－2受体参与失血性休克血管反应性双相变化的形成［2］，蛋白激酶B（PKB／Akt）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38Mitogen－Activated Protein Kinase，p38MAPK）、细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal Regulated Kinase，Erk）几种分子参与了调节过程，但具体调节机制目前尚不清楚。

根据基础研究，Ang－1和Ang－2激活血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cell，VEC）上的 Tie－2受体之后，可经磷脂酰肌醇3－激酶（Phosphatidylinositol 3－Kinase，PI3K）激活Akt，还可经过衔接蛋白Grb2活化p38MAPK和Erk，再通过激活诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）产生一氧化氮（Nitric Oxide，NO）［3，4］，NO是目前已知的一种对血管舒缩反应性有重要调节作用的分子［5］。那么 Ang－1和 Ang－2能否通过 Akt、p38MAPK和Erk激活iNOS产生NO来调节失血性休克大鼠血管反应性的双相变化即成为有重要意义的研究课题。本实验采用离体微血管环张力测定技术和Western Blotting方法，观察实验大鼠失血性休克后不同时间点SMA中iNOS蛋白表达变化、iNOS抑制剂对Ang－1和Ang－2调节缺氧早期和晚期血管反应性的影响以及给予Ang－1和Ang－2、Tie－2、Akt、p38MAPK、Erk 等 的 抑 制 剂 后 缺 氧VEC和血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC）中iNOS蛋白表达和细胞培养上清中NO含量的变化，以探讨iNOS在Ang－1和Ang－2调节休克血管反应性双相变化中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞准备

采用第三军医大学大坪医院实验动物中心清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重200～230g，戊巴比妥钠（0.1ml／100g体重）腹腔注射麻醉。

根据文献［6］进行VEC和VSMC原代细胞培养，取第3代至第5代的VEC和VSMC细胞，按照细胞计数1∶1比例进行混合培养，次日进行实验。

1.2 主要试剂

Ang－1、Ang－2、iNOS 抗 体、Akt抑 制 剂 VIII trifluoroacetate salt hydrate、Erk抑制剂PD98059、p38MAPK抑制剂SB203580均购自美国Sigma－Aldrich公司，Tie2阻断抗体购自美国Santa Cruz公司，iNOS抑制剂L－NIL hydrochloride购自英国Tocris公司，NO检测试剂盒购自德国Calbiochem公司。

1.3 实验内容

（1）取大鼠48只，麻醉后右侧股动脉插管接血压计［7］，随机将其中8只作正常对照，其余40只分为休克10min、30min、1h、2h、4h组，每组8只，经右侧股动脉放血使平均动脉压（Mean Artery Pressure，MAP）降至40mmHg，并维持不同时间，制作不同休克时间的失血性休克模型［7］。休克完成后将大鼠断头处死，取SMA组织测定iNOS的蛋白表达。

（2）另取大鼠104只，麻醉后将大鼠断头处死，分离SMA一级分支动脉血管，切割成长2.5mm的血管环（直径10～100μm），随机分为13组：正常对照组、缺氧10min组；Ang－1＋缺氧10min组、Ang－2＋缺氧10min组；iNOS抑制剂＋缺氧10min组、iNOS抑制剂＋Ang－1＋缺氧10min组、iNOS抑制剂＋Ang－2＋缺氧10min组；缺氧4h组、Ang－1＋缺氧4h组、Ang－2＋缺氧4h组；iNOS抑制剂＋缺氧4h组、iNOS抑制剂＋Ang－1＋缺氧4h组、iNOS抑制剂＋Ang－2＋缺氧4h组，每组8只血管环。实验采用Ang－1、Ang－2浓度均为200ng／ml，iNOS抑制剂浓度为1×10－4mol／L。缺氧处理方法［6］：将血管浸入无糖 Krebs－Henseleit（K－H）液，置于缺氧罐中，充入缺氧气体（5%CO2和95%N2）15min后夹闭导气管10min，反复5次，最后一次充气后，按各实验组要求分别夹闭10min或4h完成缺氧。最后测定血管反应性。

（3）取培养的VEC和VSMC混合细胞32瓶，随机分为8组：正常对照组、缺氧4h组、Ang－2＋缺氧4h组、Tie－2抑制剂＋缺氧4h组、Akt抑制剂＋缺氧4h组、p38MAPK抑制剂＋缺氧4h组、Erk抑制剂＋缺氧4h组、iNOS抑制剂＋缺氧4h组，每组4瓶。实验当天将细胞培养基换成无血清培养基，Ang－1和 Ang－2浓度均为200ng／ml，Tie－2阻断抗体1：100，Akt抑制剂1×10－5mol／L、p38MAPK 抑制剂1×10－5mol／L，Erk抑制剂1×10－5mol／L，iNOS抑制剂1×10－4mol／L。缺氧处理方法同（2），完毕后取细胞培养上清测定NO含量，收集细胞测定iNOS蛋白表达。

1.4 检测方法

1.4.1 血管反应性测定：将SMA一级分支血管环固定于微血管肌动描记仪，浸入K－H液，采用累积浓度法检测微血管环对梯度浓度去甲肾上腺素（NE）的反应性，作量－效曲线，曲线拟合法求NE的最大收缩力（Emax），以 NE的Emax评价血管反应性［8］。

1.4.2 iNOS蛋白表达：取SMA组织或细胞，提取总蛋白，常规Western Blotting方法检测蛋白条带，采用8%SDS－PAGE胶，iNOS抗体滴度1∶10 000，Quantity One软件分析蛋白条带，以iNOS／β－actin光密度比值反映iNOS蛋白表达。

1.4.3 NO含量测定：取VEC和VSMC的细胞培养上清，采用硝酸还原酶法测定NO含量，检测步骤按照NO检测试剂盒进行。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 失血性休克后不同时间iNOS的蛋白表达变化

iNOS在正常对照组表达很低（与β－actin的比值均数为0.0694），失血性休克30min后iNOS表达逐渐增高，休克30min、1h、2h和4h组均数分别增高至0.1469、0.1984、0.2595和0.2489 （P＜0.01）。见图1。

图1 失血性休克后iNOS的蛋白表达变化

2.2 iNOS抑制剂对Ang－1和Ang－2调节缺氧早期和晚期血管反应性的影响

iNOS抑制剂对离体SMA缺氧早期（10min）的血管高反应性及Ang－1、Ang－2对其的作用无显著影响，但可恢复缺氧晚期（4h）的血管低反应性，NE的Emax均数由5.875mN增高至8.937mN （P＜0.01）；还可以抑制Ang－2进一步降低血管反应性的作用，NE的Emax均数由3.444mN增高至7.492mN（P＜0.01）。见图2。

2.3 Ang－1和Ang－2调节缺氧晚期血管低反应性时iNOS蛋白表达和NO含量变化

培养VEC和VSMC混合细胞缺氧4h组的iNOS蛋白表达较正常对照组显著增高（P＜0.01），Ang－1、Tie－2抑制 剂、p38MAPK 抑 制剂 和 Erk 抑制剂可显著抑制其增高，使其光密度比值均数由缺氧4h的0.2841分别降低至0.0790、0.0924、0.0793和0.0899（P＜0.01）；Akt抑制剂对其无显著影响。见图3。

图2 iNOS抑制剂对Ang－1和Ang－2调节缺氧早期和晚期血管反应性的影响

图3 Ang－1和Ang－2调节缺氧晚期血管反应性时iNOS蛋白表达变化

混合VEC和VSMC培养上清液中NO含量在缺氧4h组较正常对照组显著增高，（30.5941vs 0.8923 μmol／108细胞，P＜0.01），Ang－1，Tie－2、Akt、p38MAPK、Erk、iNOS抑制剂均可抑制其增高，使其分别降低至15.2079、9.3667、20.0924、14.9076、13.9129和13.0048μmol／108细胞 （P＜0.05或P＜0.01）。见图4。

图4 Ang－1和Ang－2调节缺氧晚期血管反应性时NO含量变化

3 讨 论

研究显示，Ang－1和Ang－2激活VEC上的Tie－2受体之后，可经Akt、p38MAPK和Erk调节iNOS活性和 NO 产生［3，4］；还有报道，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导内毒素休克的人脐静脉内皮细胞，LPS通过磷酸化和活化 Akt、p38MAPK及Erk，激活iNOS，产生NO，调节内毒素休 克 的 血 管 反 应 性［9，10］。 因 此 推 测 Ang－1 和Ang－2可能通过Akt、p38MAPK和Erk激活iNOS产生NO，从而调节失血性休克血管反应性的双相变化。

本实验结果发现，iNOS抑制剂可明显恢复缺氧4h的血管低反应性，以及显著抑制Ang－2，进一步降低缺氧4h血管反应性的作用，提示iNOS参与了Ang－1和Ang－2对失血性休克晚期血管低反应性的调节；失血性休克后SMA中的iNOS蛋白表达逐渐增高，Ang－1、Tie－2、p38MAPK 和 Erk抑制剂可显著降低缺氧4h的VEC和VSMC混合细胞中iNOS蛋白表达和NO含量增高，提示失血性休克晚期，Ang－1和Ang－2通过p38MAPK和Erk调节iNOS的蛋白表达和NO大量产生，以调节血管低反应性。

大量文献表明，NO对机体的作用非常复杂，有报道其介导了PI3K－Akt－内皮型一氧化氮合酶（eNOS）途径对小肠缺血的保护作用［11］，但也有报道其介导了LPS诱导的血管内皮细胞损伤［10］。本实验结果提示，iNOS和NO在失血性休克晚期起到了降低血管收缩功能的损伤性作用。对于NO具有复杂作用的原因，有研究认为，NO如同一把“双刃剑”，其作用究竟是保护还是损伤主要取决于诱导NO产生的酶和NO产生的量，iNOS、eNOS和神经型一氧化氮合酶（nNOS）诱导产生的NO量之比为105∶16∶96；就心脏而言，0.1～10μmol的NO即可增强收缩，加快心率，而＞100μmol的NO则表现为负性收缩和负性频率的作用［12］。因此本实验中NO对血管反应性的损伤可能由于iNOS诱导NO大量产生所引起。但NO导致休克血管反应性损伤的具体机制尚待进一步研究。

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