三七总皂苷肠溶胶囊在比格犬体内的药代动力学

秦艳娥，刘华钢，赖 玲，陆仕华，文 丽，陈 明，刘冠萍

(1.广西医科大学药学院，广西南宁 530021;2.广西中医学院，广西南宁 530001;3.广西梧州制药(集团)股份有限公司，广西梧州 543000)

三七总皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)是中药三七的主要成分，具有扩张血管、降低心肌耗氧量和抑制血小板凝集等药理作用，目前主要应用于心脑血管系统疾病［1］。其中，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和Rg1是PNS的主要活性成分。PNS在临床上的给药途径主要为注射和口服，据资料记载［2－3］，口服制剂的生物利用度不高。本实验通过研究自制的PNS肠溶胶囊在比格犬体内的药代动力学，与市售的血栓通胶囊对照，旨在研制生物利用度较高的PNS口服制剂。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂

三七皂苷R1对照品(批号110745-200415)、人参皂苷Rg1对照品(批号110704-200318)、人参皂苷Rb1对照品(批号110703-200424)、淫羊藿苷(icariin)对照品(批号110737-200413)由中国药品生物制品检定所提供。血栓通胶囊(批号20101014)哈尔滨珍宝制药有限公司。甲醇(色谱纯)购自美国Fisher Scientific公司，乙腈(色谱纯)购自美国Tedia公司，PNS由梧州制药集团股份有限公司惠赠。

1.2 动物

比格犬，雄性，体质量8～10 kg;由广州医药工业研究院提供，动物生产许可证:SCXK(粤)2008-0007。

1.3 仪器

高效液相色谱仪(LC-10AT泵，SPD-10A紫外检测器)(日本岛津公司);Sartorius电子天平;BS224S电子天平;DT-230A柱温箱;SK-1旋涡混合器(苏州威尔实验用品有限公司);TGL-16G-A高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);101AS-2数显电热恒温干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)。

1.4 比格犬给药方案和血样采集

采用双周期自身对照交叉实验设计方法进行实验，将6只成年健康的比格犬随机分为2组，每组3只。每组犬禁食12 h(自由饮水)后，分别喂饲PNS肠溶胶囊(受试制剂)13颗(折合犬给R1，Rg1，Rb1的量分别为 8.2，46.8，31.5 mg·kg－1)或者血栓通胶囊(参比制剂)20颗(折合犬给R1，Rg1，Rb1的量分别为 10.5，57.9，43.4 mg·kg－1)。分别于药后 0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，6 和 8 h 前肢静脉采血4 ml，血样置于肝素化Eppendorf(ep)管中，800×g离心10 min，分离血浆置于－20℃冰箱保存备用。间隔7 d后交叉服药。

1.5 血浆中PNS的测定

1.5.1 PNS储备液和内标储备溶液的配置

分别精密称取 R12.4 mg，Rb113.6 mg，Rg19.2 mg，加甲醇溶解，定容至 10 ml，浓度分别为237.3，1363.1，917.5 mg·L－1作为 PNS 对照品贮备液。精密称取内标淫羊藿苷1.8 mg，加甲醇溶解，定容至100 ml作为内标溶液。

1.5.2 血浆样品预处理

精密量取比格犬血浆样品2 ml，精确加入20μl内标(internal standard，IS)淫羊藿苷溶液18 mg·L－1和甲醇∶乙腈 =1∶1的混合液 6 ml，漩涡混合 2 min，以800×g离心10 min。吸取上层混合液于ep管中，40℃水浴吹干混合液后，残渣用0.20 ml甲醇溶解，漩涡混合1 min，800×g离心10 min。

1.5.3 色谱条件

色谱柱为Welchrom-C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相为乙腈-水，线性梯度洗脱:0 min(V/V，21∶79)～15 min(V/V，40∶60)～18 min(V/V，45∶55)～20 min(V/V，21∶79)～25 min(V/V，21∶79);流速:1.0 ml·min－1;进样量:20 μl;紫外检测波长:203 nm;柱温:30℃。

1.5.4 标准曲线的绘制

在离心管中分别加入不同体积的PNS对照品溶液，40℃水浴吹干甲醇后，分别加入空白血浆0.2 ml，配制成含不同浓度PNS的生物样品。按前述1.5.2项方法进行操作，在上述色谱条件下测定PNS中R1，Rg1，Rb1与内标的峰面积之比为纵坐标，以浓度为横坐标，进行线性回归。

1.6 基于曲线下面积(area under curve，AUC)自定义权重系数(ωj)的PNS整合药动学模型的建立［4］

根据PNS给药后测得的血药浓度-时间数据，应用3P97实用药动学计算机程序，获得R1，Rb1和Rg1的AUC0→∞数据，根据各成分在 3种成分总AUC0→∞中所占比值自定义各成分在综合浓度中的(ωj)，将每一时间点下3种单体成分的血药浓度赋以各自的权重系数，求算PNS的综合浓度，进一步进行整合药动学参数的研究。PNS各成分自定义权重系数及综合浓度的计算公式如下:

式中，j分别代表R1，Rb1和Rg1;ωj表示上述成分AUC在3种成分总AUC中的比值;CT为自定义权重系数校正后PNS在犬体内的综合浓度。

2 结果

2.1 血浆中PNS质量浓度的方法学确认

2.1.1 方法专属性

按前述色谱条件和血浆处理方法处理和检测空白血浆、加药血浆和血浆样品见图1。R1，Rg1，Rb1与内标淫羊藿苷的保留时间分别为12.5，13.7，21.0及17.5 min，峰形良好，分离完全，无杂质干扰。

Fig.1 Chromatograms of Panax notoginseng saponins(PNS)by HPLC.A:blank plasma;B:plasma spiked with R1，Rg1，icariin and Rb1(1.1，4.4，3.6 and 3.2 mg·L －1)standard;C:plasma sample of PNSenteric-coated capsules in dogs after po 86.2 mg·kg－1 for 1.5 h.1:notoginsenoside R1;2:ginsenoside Rg1;3:icariin;4:ginsenoside Rb1.

2.1.2 标准曲线

R1，Rg1和Rb1的校正标准曲线方程分别为:Y=22.266X －2.4731(r=0.9981);Y=24.95X －30.463(r=0.9965)以及 Y=31.886X －14.511(r=0.9983)。R1，Rg1和 Rb1线性范围分别为 1.0 ～79.1 mg·L－1，0.9 ～ 90.9 mg·L－1和0.9 ～91.8 mg·L－1;检测限分别为0.1，0.2和0.2 mg·L－1;定量限分别为 0.3，0.4 和0.4 mg·L－1。

2.1.3 回收率

由表1可见，在实验浓度范围内，R1，Rg1，Rb1在血浆中的提取回收率均大于50%，完全符合生物样品分析的要求［5］。

Tab.1 Method recovery and extraction recovery of HPLC assay

2.1.4 精密度和稳定性

测得 R1，Rg1和 Rb1的日内相对标准偏差(RSD)均小于2.0%，日间RSD均小于3.0%。24 h内样品在常温及4℃冰箱中的质量浓度没有明显的变化(RSD ＜1.9%)。

2.2 犬体内药代动力学

受试制剂、参比制剂和整合后的平均血药浓度-时间曲线见图2。应用3P97实用药物动力学计算机程序，根据残差平方和(SUM)、Akaike(AIC)法、拟合度法(r2)等房室模型判断标准进行选择，以一室模型，权重为1/C2时，效果最好，主要药动学参数计算结果见表2。

经剂量换算后，R1，Rb1，Rg1和各成分的AUC整合后PNS的相对生物利用度分别为248.41%，107.19%，152.94%和155.31%。所得到的 PNS 在犬体内整合血药浓度-时间曲线符合经典的药动学特征，可用经典的房室模型进行整合药动学参数的求算。基于AUC0－∞自定义ωj的PNS整合药动学参数见表3。

Fig.2 Plasma concentration-time profiles of PNS after PNS enteric-coated capsules and Xueshuantong capsule given to Beagle dogs.A:notoginsenoside R1;B:ginsenoside Rg1;C:ginsenoside Rb1;D:plasma concentration-time profiles of PNSafter integration.±s，n=6.

Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of PNS enteric-coated capsules and Xueshuantong capsule in dogs

Tab.3 Main pharmacokinetic parameters of PNS entericcoated capsule and Xueshuantong capsule in dogs after the integration of blood concentration based on AUC0→∞

3 讨论

本课题组建立了比格犬血浆中PNS浓度的RPHPLC测定方法，以淫羊藿苷为内标采用梯度洗脱，在此条件下基线平稳，各主要测定峰能达到良好分离;血样处理方法较为简单，适用于PNS体内浓度分析。

由于梧州制药提供的PNS中3种皂苷的含量和血栓通胶囊的不同，因此在犬给药时，无法做到各种皂苷的给药量一致，计算相对生物利用度时，都会进行计量折算。

本实验研究发现PNS中3种主要成分R1，Rb1和Rg1在犬体内的药动学参数差异较大，很显然，任何单一成分的药动学行为均不能用于表征PNS的整体药动学行为。基于AUC0→∞分析的PNS整合药动学能够更科学地反映PNS在犬体内的药动学行为［4］。

PNS在胃液内不稳定，各种有效成分主要在小肠吸收［6］。肠溶胶囊壳能有效的保护PNS到达小肠，从而提高生物利用度。对自制的PNS肠溶胶囊进行了体内药动学研究，结果显示，与参比制剂相比，药物在犬体内吸收的达峰时间和延迟时间均延长。基于AUC0→∞分析的PNS整合药动学也有相同的结论。由于PNS中三种成分的相对分子质量和极性较大，比较难透过肠壁类脂膜，因此其绝对生物利用度较低。一些体外研究表明吸收促进剂能促进PNS透膜吸收［7］，那么在体内吸收促进剂的效果如何，需要进一步的研究。本实验对于这种分子质量和极性较大、在胃液中不稳定的物质的口服制剂的开发和研究，提供了参考借鉴。

［1］Zhang JF，Zhang DF.Study advancement in pharmalcological actions of total saponins of Panax notoginseseng［J］.Med Recapit(医学综述)，2007，13(6):472-474.

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