低浓度亚硝酸钠预处理对高浓度亚硝酸钠损伤PC12细胞的保护作用

李延红，周占业，史 齐，皇甫超申

(河南大学1.医学院环境医学研究所，2.第一附属医院，河南开封 475004)

亚硝酸盐广泛存在于自然界水体、土壤、植物中，常用于食品保鲜剂和工业防腐剂，也被用于临床治疗氰化物中毒。亚硝酸盐对人体健康的影响目前存在很大争议［1］。过去普遍认为亚硝酸盐可以导致高铁血红蛋白血症并有致癌风险，现在不断有研究表明，低浓度亚硝酸盐具有保护血管内皮、降血压和预防动脉粥样硬化等对人体有利的一面［2］。这就使得亚硝酸盐这一古老的化合物有了新的研究价值。有实验表明，环境化学毒物或物理损伤因子对组织细胞的作用效应呈现出低浓度和高浓度作用相反的现象，该现象被称为低促效应(hormesis)［3］，化合物在低促效应浓度范围内引起的促进效应超过对照组10%的浓度称之为最低促进浓度，用该浓度化合物预处理组织细胞，可以使其耐受该化合物高浓度的毒害作用［4］。为此，本文研究了低浓度亚硝酸钠(NaNO2)预处理对高浓度NaNO2损伤PC细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤未分化型细胞株PC12购自中国医学科学院基础医学研究所。硝酸钠(NaNO3)、NaNO2，无水乙醇，天津市晨福化学试剂厂(分析纯);高糖DMEM培养基(Gibco);胎牛血清，杭州四季青生物公司产品;羧基-2-(4-羧基)苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧-3-氧化物(carboxy-2-(4-carbo-xyphenyl)-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide，c-PTIO)、二甲亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、Hoechst33258和碘化丙啶(propodium iodiole，PI)购自Sigma公司。FITC-AnnexinⅤ/PI细胞凋亡检测试剂盒(Bender)增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)显色试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG及β肌动蛋白抗体(碧云天公司)。可见光法丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。BX51型荧光显微镜(日本Olympus公司);FACS Salibur型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 细胞培养

PC12细胞生长在含10%的胎牛血清的DMEM培养基中，置5%CO237℃培养箱培养。3 d换液1次为1代。

1.3 MTT分析细胞存活率

PC12细胞于5%CO237℃恒温培养。至对数生长期，用胰酶和EDTA消化，调整细胞数为1×107L－1接种到96孔细胞培养板，每孔0.2 ml，继续培养24 h后换液。根据前期实验结果［5］，本实验分别选用NaNO20.14，1.4 和 45 mmol·L－1浓度组，同时设同浓度的 NaNO3或 c-PTIO 40 μmol·L－1+NaNO3组。细胞继续培养24 h，每孔加入 20 μl MTT 5 g·L－1培养4 h后，吸去培养液，每孔加入150μl DMSO于振荡器上振摇，待蓝色晶体完全溶解后，在酶标仪上测定570 nm处的吸光度(absorbance，A)。以含有等体积的培养液和DMSO的无细胞孔测得的吸光度值为空白对照。实验重复3次。细胞存活率(%)=(A处理组－A空白组)/(A对照组－A空白组)×100% 。

1.4 活细胞荧光染色判定细胞生存状态

实验分4组:正常对照组，只加等体积的培养液;NaNO245 mmol·L－1组，NaNO245 mmol·L－1处理细胞2 h;预处理组，NaNO20.14 mmol·L－1预处理24 h，然后再用 NaNO245 mmol·L－1处理 2 h;NO 清除组，c-PTIO 40 μmol·L－1+NaNO20.14 mmol·L－1共同预处理细胞24 h后再用NaNO245 mmol·L－1作用2 h。将不同处理的细胞培养在预置盖玻片上，PBS洗3次，用特异结合DNA的荧光染料Hoechst 33258和PI联染进行活细胞联染。加Hoechst33258 10 mg·L－1及 PI 10 mg·L－1，37℃染色 15 min 后，紫外激发，荧光显微镜观察细胞形态变化，CCD拍片。活细胞呈浅蓝色，凋亡细胞呈凝集的红色或亮白色。荧光显微镜下随机选择5个视野，每张爬片计数细胞不少于1000个，实验重复3次，以凋亡细胞数与计数的总细胞数百分比表示细胞凋亡率。

1.5 FITC-AnnexinⅤ/PI双染法流式细胞术测定细胞凋亡

按实验要求处理后，分别收集各组细胞到10 ml的离心管中，每样本细胞数为1×109L－1，1000 ×g离心5 min，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次，1000×g离心5 min，用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15 min，1000×g离心5 min，沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入AnnexinⅤ-FITC/PI溶液5 μl，4℃下孵育20 min，最后补 PBS 400 μl，以流式细胞仪检测细胞凋亡情况。每个样品检测1万个细胞，用Cellquest软件进行细胞凋亡分析。

1.6 细胞内MDA含量和GSH-Px，SOD，CAT酶活性分析

实验步骤按试剂盒说明书进行，比色法测定细胞内MDA，GSH-Px含量和SOD，CAT酶活性。实验重复3次。

1.7 Western印迹法检测相关蛋白表达

细胞于对数生长期进行各种处理，作用24 h后用RIPA 200μl充分裂解提取蛋白，考马斯亮蓝G-250法测样品蛋白浓度，均衡每组蛋白浓度后，以12%SDS-PAGE凝胶电泳分离。电转移蛋白至NC膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入各种一抗(1∶200)于4℃封闭袋中孵育过夜，二抗(1∶4000)孵育1 h。化学发光法显示结果，压片曝光，凝胶图像分析系统拍照，并测定蛋白质印迹条带积分吸光度值(integrated absorbance，IA)，以 与β肌动蛋白的IA比值为蛋白相对表达量。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 NaNO2对PC12细胞存活率的影响

图1 结果显示，NaNO20.14 和 1.4 mmol·L－1组细胞存活率较正常对照组分别增加15%和56%，NaNO245 mmol·L－1组细胞存活率较正常对照组减少46%(P＜0.05)。同时加入c-PTIO后，细胞存活率较相应浓度单独NaNO2组明显降低(P＜0.05)，但NaNO2对细胞存活率的低浓度促进高浓度抑制现象依然存在，未恢复至正常对照组水平(P＜0.05)。NaNO30.14 ～45 mmol·L－1对细胞存活无明显影响。

Fig.1 Effect of sodium nitrite(NaNO2)on the survival rate of PC12 cells.PC12 cells were cultured with drugs for 24 h.Survival rate(%)=(A treatment － A blank)/(A control － A blank).¯x ± s，n=3.*P ＜0.05，compared with normal control(0 mg·L －1)group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 group.

2.2 低浓度NaNO2预处理对高浓度NaNO2损伤PC12细胞存活率的影响

如图2所示，与正常对照组相比，NaNO245 mmol·L－1处理组细胞存活率明显下降(P ＜0.05)。与NaNO245 mmol·L－1组相比，预处理组细胞存活率明显增加(P＜0.05)。与预处理组相比，预处理时同时加入c-PTIO 40μmol·L－1的NO清除组细胞存活率进一步明显下降(P＜0.05)。

Fig.2 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on cell survival exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by MTT.Cells were preconditioned with NaNO2 0.14 mmol· L－1 or NaNO2 0.14 mmol·L －1+c-PITO 40 μmol·L－1 for 24 h， then NaNO2 45 mmol·L －1 was added for anther 2 h cultivation.1:normal control group;2:NaNO2 group;3:NaNO2 0.14+NaNO2 45 group;4:c-PTIO+NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

2.3 低浓度NaNO2预处理对高浓度NaNO2损伤PC12细胞凋亡的拮抗作用

FITC-AnnexinⅤ/PI双染法流式细胞术检测结果(图3)可见，正常对照组PC12细胞有少量细胞凋亡，NaNO245 mmol·L－1可诱导大批细胞凋亡，与正常对照组相比差异显著(P＜0.05)。与NaNO245 mmol·L－1组相比，NaNO20.14 mmol·L－1预处理组细胞凋亡率明显减少(P＜0.05);与 NaNO20.14 mmol·L－1预处理组相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245 mmol·L－1组细胞凋亡率进一步增高(P＜0.05)。

2.4 低浓度NaNO2预处理对NaNO2高度浓损伤PC12细胞的形态学变化

Fig.3 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on cell apoptosis exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by FITC-annexinⅤ/PI double staining flow cytometry assay.See Fig.2 for the treatment.1:normal control group;2:NaNO2 group;3:NaNO2 0.14+NaNO2 45 group;4:c-PTIO+NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

Hoechst33258/PI活细胞双染结果可见(图4)，正常对照组细胞，生存状态良好，有少量细胞凋亡;NaNO245 mmol·L－1处理导致大量细胞凋亡，凋亡率明显高于正常对照组(P＜0.05);预处理组细胞凋亡率与NaNO245 mmol·L－1组相比 ，明显减少 (P＜0.05);与预处理组相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245组细胞凋亡率明显降低(P＜0.05)。

2.5 低浓度NaNO2预处理对高浓度NaNO2损伤PC12细胞抗氧化能力的影响

如表1所示，与正常对照组相比，NaNO245 mmol·L－1处理组细胞内 CAT、SOD 和 GSH-Px活性明显降低，MDA含量升高(P＜0.05);与NaNO245 mmol·L－1组相比，NaNO20.14 mmol·L－1预处理组细胞内抗氧化酶活力明显升高，而MDA含量明显下降(P ＜0.05)。与 NaNO20.14 mmol·L－1预处理组相比，c-PTIO 40 μmol·L－1+NaNO20.14+NaNO245组抗氧化酶活性进一步明显降低，MDA含量明显升高(P＜0.05)。

Fig.4 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on cell nucleus morphology exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by Hoechst33258/PI double staining.See Fig.3 for the legend.B was the statistical results of A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

Tab.1 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on activities of catalase(CAT)，superoxide dismutase(SOD)，glutathione peroxidase(GSH-Px)and malondialdehyde(MDA)content in PC12 cells exposed to NaNO2 45 mmol·L －1

2.6 低浓度NaNO2预处理对高浓度NaNO2损伤PC12细胞影响

图5结果显示，与对正常照组相比，NaNO245 mmol·L－1处理细胞可明显诱导细胞促凋亡蛋白Bax，胱天蛋白酶9，胱天蛋白酶3表达增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表达减少(P＜0.05)。与NaNO245 mmol·L－1组相比，NaNO20.14 mmol·L－1预处理组细胞促凋亡蛋白 Bax，胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表达量下降，而凋亡抑制蛋白 Bcl-2表达量增加(P＜0.05)。与预处理组相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245组细胞促凋亡蛋白Bax，胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表达量有所增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表达量有所减少(P＜0.05)。

Fig.5 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L－1 preconditioning on the expression of apoptosis-related proteins in cells exposed to NaNO2 45 mmol·L－1 by Western blotting assay.See Fig.3 for the legend.Bwas the statistical results of A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 mmol·L －1 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

2.7 低浓度NaNO2预处理对高浓度NaNO2损伤PC12细胞HIF-1α蛋白表达的影响

图6结果显示，与正常对照组相比，NaNO245 mmol·L－1组细胞 HIF-1α 表达量有所增加(P ＜0.05);与 NaNO245 mmol·L－1组相比，NaNO20.14 mmol·L－1预处理组 HIF-1α 表达量明显增加(P ＜0.05);与 NaNO20.14 mmol·L－1预处理组相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245 组 HIF-1α 表达量进一步明显下降(P＜0.05)。

Fig.6 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on the expression of hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in PC12 cells exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by Western blotting assay.See Fig.3 for the legend.Fig.B was the statistical results of Fig.A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜ 0.05，compared with NaNO2 45 mmol·L －1 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

3 讨论

高浓度NaNO2可以造成细胞膜损害和DNA过氧化损伤，并诱导细胞坏死和凋亡［6］，低浓度NaNO2对组织细胞却没有明显的毒害作用［7］。本实验发现，NaNO20.14 和 1.4 mmol·L－1对 PC12 细胞存活率有促进作用，而 NaNO245 mmol·L－1明显抑制细胞存活率;加入c-PTIO清除培养体系中的一氧化氮后，细胞存活率总体有所下降，但NaNO2对细胞存活率的低浓度促进高浓度抑制现象依然存在，而相同浓度的硝酸钠对细胞活力无影响。结果提示，NaNO2可以引起PC12细胞存活率低浓度促进效应(低促效应)。这种现象很可能与一氧化氮-可溶性鸟苷酸环化酶-环一磷酸鸟苷通路激活有关［8］。在低促效应浓度范围内，本实验选用最低促进浓度，即 NaNO20.14 mmol·L－1预处理后，细胞抗氧化能力增强、脂质过氧化水平降低、线粒体凋亡通路上促凋亡蛋白表达下降、凋亡抑制蛋白表达升高以及细胞凋亡减少。有研究认为这种现象是由于低浓度毒物预处理，细胞通过自稳态调整，获得了耐受更高浓度毒物的损害作用［9］。也有研究认为低浓度NaNO2在体内缺氧酸性环境下可以还原为一氧化氮，一氧化氮抑制线粒体呼吸链，减少活性氧产生，抑制细胞色素C释放，从而减轻细胞过氧化损害和拮抗线粒体途径凋亡［10］。本实验是在普通条件下培养的，培养液pH值由实验开始时的7.3，到实验结束时降到6.3左右，在这种环境，培养体系中的亚硝酸盐有可能部分还原为一氧化氮。用低浓度NaNO2预处理 PC12细胞，细胞获得耐受高浓度NaNO2诱导的细胞凋亡现象很可能与亚硝酸根离子和一氧化氮抑制线粒体呼吸链复合物，抑制细胞内氧的消费，减少活性氧产生，同时抑制线粒体细胞色素C的释放，减少线粒体途径凋亡有关。这种现象在NaNO2预处理拮抗缺血再灌注时活性氧诱导的细胞凋亡实验中也得到证实［11］。

细胞内HIF是一类进化上高度保守的核转录因子，在缺氧条件下累积，调控其下游红细胞生成素、血管内皮生长因子和糖酵解等一系列与细胞低氧存活有关的基因，使细胞耐受缺氧或其他应激环境［12］。本实验发现，低浓度NaNO2预处理的细胞，HIF表达增加，这可能与低浓度亚硝酸盐抑制细胞氧消费有关。结果提示，低浓度NaNO2促进细胞存活率增加，拮抗高浓度NaNO2对细胞过氧化损伤诱导的细胞凋亡现象，与其促进HIF在细胞内累积增加有关。

低浓度NaNO2促进PC12细胞存活率，高浓度抑制其存活率;低浓度NaNO2预处理PC12细胞可以增强细胞抗氧化能力，增加HIF-1α在细胞内累积，拮抗高浓度NaNO2过氧化诱导的细胞线粒体途径凋亡，亚硝酸盐还原的一氧化氮和亚硝酸根离子在其中协同发挥了重要作用。

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