聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子对猕猴辐射致粒细胞减少症的治疗作用

李 娜，陈 方，欧 伦，孙 效，2，邹 佳，董立厚，王清清，宋海峰

(1.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850;2.总后勤部丰台综合仓库药材供应站，北京 100071)

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，GCSF)可以通过影响造血干/祖细胞和骨髓微环境、细胞凋亡等方面［1］，特异性刺激和调节粒系祖细胞的增殖和分化，最终促进中性粒细胞的成熟和释放。利用基因重组技术生产的人重组GCSF(rhGCSF)是防治肿瘤放化疗引起的中性粒细胞减少症的有效药物，临床应用近20年，已经取得很多经验［2－3］。rhGCSF可以使患者更好耐受高剂量强度或剂量密集性化疗，扩大治疗患者的范围［4］，还用于高剂量化疗联合自体造血干细胞移植的干细胞动员与移植后造血功能重建［5］;另外，rhGCSF也可用于治疗骨髓发育不良、获得性免疫缺陷综合征、粒细胞产生遗传性障碍等疾病所引起的中性粒细胞减少症［6］。但是，rhGCSF半衰期短、需频繁给药等问题给临床应用带来不便。目前，虽然国内已有多种长效形式的GCSF药物正处于研发阶段［7］，但距临床应用尚有时日。

本研究的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)rhGCSF(PEG-rhGCSF)是将重组粒细胞集落刺激因子用20 ku的PEG分子修饰后获得的一种安全、长效的新型制剂。为了更接近临床患者治疗的实际情况，得到更可靠的数据，本研究选择了灵长类动物进行实验，并且建立了猕猴辐射致造血损伤模型，模拟了临床放化疗所致的粒细胞减少症，重点观察PEG-rhGCSF对模型猕猴粒细胞减少症的治疗作用，为之后的临床研究提供有效的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

PEG-rhGCSF(批号200704Z01)及 rhGCSF(批号200704G01)，均由江苏恒瑞医药股份有限公司提供。硫酸庆大霉素注射液购于天津药业焦作有限公司，注射用青霉素钠购于石家庄制药集团有限公司;注射用头孢他啶购于海南国瑞堂制药有限公司，注射用头孢噻肟钠购于国药集团国瑞药业有限公司。

pocH-100iV Diff血细胞计数仪为日本Sysnex公司产品;BX-40型显微镜为Olympus产品。

1.2 动物、照射及分组

动物随机分成5组:照射模型组(n=6)，PEG-rhGCSF 30，100 和 300 μg·kg－1组(n=5)，rhGCSF 10 μg·kg－1组(n=5)。

猕猴于照射后24 h开始给药，均采用sc给药方式。PEG-rhGCSF各剂量组均给药1次;rhGCSF对照组每天给药1次，连续10 d，给药总量与PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1组相同;照射模型组给予相同体积的生理盐水。

1.3 观察指标

1.3.1 临床表现

每日2次观察动物的活动状态、食欲、粪便、体温和体表皮肤出血或感染灶。动物体温≥39.5℃或白细胞计数(white blood cell count，WBC)≤2×109L－1时，给予抗生素支持。

1.3.2 外周血象检查

动物照射造模当天记为第0天，照射后24 h开始给药，给药当天记为第1天。观察期间第1～第10天内每天采集血样1次，第10～第49天内每2 d采集血样1次。采用pocH-100iV Diff血细胞计数仪检查外周血象，检测抗凝全血样品中的WBC、绝对中性粒细胞计数(absolute neutrophil count，ANC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(platelet count，PLT)。当模型动物 ANC≤2.0×109L－1时可诊断为粒细胞减少症。

1.3.3 骨髓象检查

每组各取2只动物于照射后15 d行骨髓穿刺，取骨髓液制作涂片，并用Wright-Giemsa染色后，进行各型骨髓系细胞计数，观察骨髓象的变化情况。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 临床表现

照射模型组动物在照射24 h后，有4只动物出现腹泻，其中2只排黏液便，1只动物WBC明显减低。2～10 d时，所有动物均出现食欲下降，严重者开始拒食，伴有不同程度持续腹泻和发热，同时止血时间明显延长，有3只动物WBC持续减低、PLT在9 d左右出现明显减低。该组动物在po给予十六角蒙脱石 3 g·d－1、im 给予酚磺乙胺 0.25 g·d－1、iv 给予青霉素钠80 kU·d－1辅助药物后，腹泻和出血的症状有所缓解，但精神状态仍不佳。

PEG-rhGCSF 30 μg·kg－1组有 1 只动物于照射后第4～第7天期间出现发热，1只动物WBC减低。PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1组动物生理状态较好，未出现食量下降的现象，动物体温也未出现持续升高，照射后2 d，仅有1只动物出现腹泻。PEG-rhGCSF 300μg·kg－1组在照射后第1～第3天期间有3只动物腹泻，但均未出现发热现象。腹泻个体在po给予十六角蒙脱石3 g后，第1～第3天腹泻症状均停止。rhGCSF组动物照射后1 d有2只出现腹泻、呕吐现象，2 d时，有1只动物拒食、萎靡，至第10天时仍有2只动物持续发热。

观察期结束时(第49天)所有动物均未死亡，除照射模型组外，其他给药组动物的体重均略有增加，但无统计学差异(数据略)。

2.2 PEG-rhGCSF对辐射致粒细胞减少症猕猴外周血ANC及WBC的影响

照射后，全部猕猴外周WBC迅速降至初始值(6.5 ×109L－1～12.5 ×109L－1)的 15% ～25%，ANC 降至初始值(4.5×109L－1～8.5 ×109L－1)的12%～20%，照射模型组符合中度骨髓型造血损伤判断标准［8］。

给药后，各组猕猴外周血ANC的变化结果见表1。ANC变化趋势(表2)与实验组WBC(表3)基本一致。猕猴接受照射后第2天(即给药后第1天)，照射模型组ANC迅速下降，而rhGCSF与PEG-rhGCSF组的外周血ANC及WBC则开始升高:PEG-rhGCSF各组均出现一过性的ANC升高峰，且峰值与剂量呈正相关;rhGCSF组ANC缓慢升高，到第7天左右达峰水平，峰值也低于等剂量的PEG-rhGCSF组。照射模型组、rhGCSF组及 PEG-rhGCSF各剂量组的ANC分别于20 d，18 d，24 d左右时下降至谷值;与前两组相比，PEG-rhGCSF各剂量组的ANC谷值均有提高。

各给药组照射后粒细胞减少症持续时间明显短于照射模型组，尤其是 PEG-rhGCSF 300 μg·kg－1组(P ＜0.01)。PEG-rhGCSF 30，100 和 300 μg·kg－1组及rhGCSF组的抗生素需求平均天数与照射模型组相比有显著差异，分别为(3.2±2.9)d(P＜0.05)，(1.4 ±1.9)d(P ＜ 0.01)，(0.2 ± 0.4)d(P ＜0.01)和(1.6 ±2.1)d(P ＜0.01)(表2)。

虽然rhGCSF组在连续注射期间，ANC一直处于较高水平，但停药后迅速降低;至停药后2 d(即rhGCSF初次给药后第12天)，ANC已经低于相同给药量的 PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1组。PEG-rhGCSF 100μg·kg－1单次注射即与rhGCSF连续注射的药效行为相近，而 PEG-rhGCSF 300 μg·kg－1的治疗作用则明显优于rhGCSF。PEG-rhGCSF对RBC及PLT数影响不明显(数据未显示)。

2.3 PEG-rhGCSF对辐射致粒细胞减少症猕猴骨髓象的影响

骨髓涂片结果显示，rhGCSF组及PEG-rhGCSF 100和300 μg·kg－1组均可见骨髓增生活跃(见图1)，主要是粒系细胞的增殖分化增加;PEG-rhGCSF 30μg·kg－1组较照射模型组增生活跃。rhGCSF组粒红比值为2.00∶1，PEG-rhGCSF 300，100 和 30 μg·kg－1组分别为2.65∶1，1.98∶1和1.91∶1，照射模型组为0.45∶1。

Tab.1 Effect of polyethylene glycolated recombinant human granulocyte colony stimulating factor(PEG-rhGCSF)on peripheral blood absolute neutrophil count(ANC)in rhesus monkeys with radiation-induced neutropenia

Tab.2 Neutrophil-related parameters in 60 Co-γ irradiated rhesus monkeys treated with PEG-rhGCSF

Tab.3 Effect of PEG-rhGCSF on peripheral blood WBC in rhesus monkeys with radiation-induced neutropenia

Fig.1 Effect of PEG-rhGCSF on bone marrow smear from rhesus monkeys with radiation-induced neutropenia(Wright-Giemsa ×40).See Tab.1 for the legend.A:model group;B:PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1 group;C:rhGCSF 10 μg·kg－1 group.

3 讨论

近年来，rhGCSF类长效药物的研发备受关注。长效药物修饰技术主要有以下两种策略:第一种是利用血浆半衰期长的蛋白，如白蛋白，IgG或转铁蛋白的 Fc段等作为治疗性蛋白的载体［9－10］;第2种是PEG化修饰技术，现已被广泛应用并取得了许多成功经验［11］。其中，利用 PEG修饰技术研制的Neulasta作为国内外唯一上市的长效rhGCSF药物，疗效明确且耐受性良好，但是高剂量需求使其在临床使用时费用昂贵。

本文研究的PEG-rhGCSF是我国自主研发的一种新型rhGCSF类长效制剂，PEG修饰后的药物很大程度上减少了肾清除、细胞摄取和蛋白水解，使药物在体内的循环半衰期大大高于修饰前的蛋白，PEG-rhGCSF消除的主要途径仅为粒细胞受体介导的清除［12］。本实验室曾研究过 PEG-rhGCSF在正常猕猴体内的药代动力学行为及药效作用，发现当粒细胞处于正常水平时，粒细胞表面的受体会使PEG-rhGCSF的消除显著加快，影响PEG-rhGCSF在体内真实的药动和药效行为。基于此点，我们在猕猴体内建立了造血系统损伤模型，使体内粒细胞处于一个较低水平，不足以影响到药物真实的药动学及药效行为;另外，尽可能准确研究其在临床恶性肿瘤患者接受放疗或化疗后所致造血功能损伤引起的粒细胞减少/缺乏症的治疗效果，也是建立此动物模型的初衷。

研究结果显示，PEG-rhGCSF可以升高外周血白细胞数，主要表现为提高中性粒细胞百分比，迅速促进损伤机体造血功能的恢复，减少发热或感染的发生，且治疗效果存在剂量依赖性。骨髓涂片结果显示，给药组猕猴骨髓增生活跃，主要是粒系增殖、分化成熟，由骨髓释放至外周血液，发挥升高外周血白细胞功效。PEG-rhGCSF较rhGCSF，药效作用明显延长，其单次给药后升高白细胞、中性粒细胞的药效作用与rhGCSF多次给药相当。

作为一种新型、安全、长效的 rhGCSF制剂，PEG-rhGCSF不但降低了给药频率及治疗成本，提高患者的依从性，而且还可以减少血药浓度的波动及多次注射引起的不良反应，有着良好的临床应用前景，本文的研究结果为今后该药的进一步临床研究提供了参考和依据。

［1］Link Dc.Mechanisms of granulocyte colony-stimulating factor-induced hematopoietic progenitor-cell mobilization［J］.Semin Hematol，2000，37(Suppl 2):25-32.

［2］Dale DC.Advances in the treatment of neutropenia［J］.Curr Opin Support Palliat Care，2009，3(3):207-212.

［3］Sung L，Dror Y.Clinical applications of granulocytecolony stimulating factor［J］.Front Biosci，2007，12:1988-2002.

［4］Renwick W，Pettengell R，Green M.Use of filgrastim and pegfilgrastim to support delivery of chemotherapy:twenty years of clinical experience［J］.BioDrugs，2009，23(3):175-186.

［5］Shi YK， Sun Y. Application of hematopoietic growth factors in malignancy chemotherapy［J］.Oncol Prog，2003，1(2，3):91-112.

［6］D'Souza A，Jaiyesimi I，Trainor L，Venuturumili P.Granulocyte colony-stimulating factor administration:adverse events［J］.Transfus Med Rev，2008，22(4):280-290.

［7］Shi YK， Liu P， Yang S， Han XH，He XH，Ai B，et al.PhaseⅠ clinical trial of intravenous pegylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor［J］.Chin J Cancer(癌症)，2006，25(4):495-500.

［8］Mao BZ，Chen JP.Fundamental and Clinics of Acute Radiation Sickness(急性放射病基础与临床)［M］.Beijing:Military Medical Science Press，2002:134-138，152-157.

［9］Ma GC，Chen SQ，Zhu ZH，Huang YS，Pan HQ，Zhou JB.Pharmacokinetics of PEG-rhG-CSF and rHSA-hG-CSF in mice determined with ELISA［J］.Acta Pharmaceutica Sin，2007，42(2):197-200.

［10］Huang YS，Wen XF，Wu YL，Wang YF，Fan M，Yang ZY，et al.Engineering a pharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating factor by fusion with gelatin-like-protein polymer［J］.Eur J Pharm Biopharm，2010，74(3):435-441.

［11］Veronese FM，Mero A.The impact of PEGylation on biological therapies［J］.BioDrugs，2008，22(5):315-329.

［12］Morishita M，Leonard RC.Pegfilgrastim;a neutrophil mediated granulocyte colony stimulating factor-expanding uses in cancer chemotherapy［J］.Expert Opin Biol Ther，2008，8(7):993-1001.