大补阴丸对真性性早熟模型大鼠的治疗作用

陈永霞，程 敏，缪云萍，叶小弟，郑高利

(1.浙江中医药大学药学院药理研究室，浙江杭州 310053;2.浙江省医学科学院药理研究室，浙江杭州 310013)

性早熟是指儿童青春期特征提早出现、生长发育异常的内分泌疾病，一般将女孩8岁和男孩9岁以前呈现第二性征定义为性早熟。性早熟可分为促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)依赖型性早熟(真性性早熟)、非GnRH依赖型性早熟(假性性早熟)和不完全性性早熟［1］，其中以真性性早熟最为常见。中医治疗真性性早熟多采用滋阴降火、疏肝解郁和化痰散结等方法，以滋阴泄火法最为常用。大补阴丸作为滋阴泄火的代表方剂，临床上发现可以治疗真性性早熟，且疗效显著，但尚缺少具有严格实验设计的临床试验报告，也未见有基础性实验研究报道。本研究采用达那唑诱导的真性性早熟大鼠模型［2］，通过半定量逆转录(RT)-PCR法对性早熟大鼠下丘脑调节青春期启动的关键基因进行研究，以阐述大补阴丸对真性性早熟的治疗作用，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD清洁级未孕大鼠，250～300 g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(浙)2008-0033。饲养于屏障系统实验室，温度19～29℃，湿度40% ～80%，照明时间每天8:00－17:00，全价营养配方饲料。雌雄2∶1配种，每天早晨定时查看阴栓，有阴栓的选用母鼠单独饲养于塑料笼子中，贴上标签，标签写明配种日期、阴栓日期和笼号。阴栓后第19天开始查看仔鼠出生情况，选择出生5 d的雌性仔鼠用于实验。

1.2 药物和试剂

达那唑购自江苏联环药业股份有限公司，批号:20090302，以乙二醇/乙醇(V∶V=1∶1)的混合液配制成12 g·L－1溶液，每只大鼠sc给予25μl;大补阴丸购自杭州胡庆余堂药业有限公司，国药准字Z33020137，批号:100807，碾细后用蒸馏水配成不同浓度的混悬液;亮丙瑞林(leuprorelin)购自杭州中肽生化有限公司，批号:CI-08-00118，以生理盐水配成200 mg·L－1溶液。Trizol购自美国 Invotrigen公司;M-MLV逆转录酶、Taq酶、dNTP、RNAsin和 Oligo(dT)15均为美国Promega公司产品;促性腺激素释放素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)，Kiss-1和G蛋白偶联受体54(G protein-coupled receptor 54，GPR54)引物合成与设计由上海生物工程有限公司完成，GnRH引物:上游5'-ACTCGTTAATGCCTGGCAAAAGG-3'，下游 5'-AGGCCAAAGGAGTTCCAGTT-3'，产物 225 bp;GPR54引物:上游 5'-CTTAGCATCTGGGTGGGTTC-3'， 下 游 5'-AGGTATAGGGCCAGCAGGTT-3'，产物 152 bp;Kiss-1引物:上游 5'-AGCACTGGTCCTATGGGTTG-3'，下游 5'-CAGACGTTCCAGAGCTCCTC-3'， 产 物 175 bp;β肌动蛋白上游5'-GTCGTACCACTGGCATTGTG-3'，下 游 5'-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3'， 产 物181 bp。

1.3 仪器

MOTIC生物显微图像采集分析系统为厦门麦奥迪克仪器公司产品;ALE200型电子分析天平为日本Libor公司产品;多功能酶标仪为美国Dynex公司产品;紫外分光光度计为德国Eppendorf公司产品;Sigma-Sartorius 1-15k型台式低温高速离心机为德国德国赛多利斯公司产品;MJ-Research PTC-200型PCR仪为杭州宝城生物技术有限公司产品;Alpha Innotech FC2型化学发光凝胶成像仪为杭州东胜创新生物科技有限公司产品;美国Bio-Rad电泳仪为杭州宝城生物技术有限公司产品。

1.4 动物分组及给药

5日龄SD雌性大鼠60只，随机分为正常对照组、模型组、亮丙瑞林阳性对照组及大补阴丸0.81，1.62 和3.24 g·kg－1组，共6 组，每组10 只。除正常对照组，其余各组大鼠均于分组当日一次性sc给予达那唑30μg·g－1，建立性早熟大鼠模型，阴门开启日龄较正常对照组显著提前说明模型成功。常规饲养至15日龄，大补阴丸组ig给予大鼠大补阴丸20 ml·kg－1，剂量分别为 0.81，1.62 和 3.24 g·kg－1，每天1次;正常对照组和模型组则ig给予自来水，阳性对照组 sc 给予亮丙瑞林 0.5 ml·kg－1，剂量为 100 μg·kg－1，每天1次。观察大鼠的阴门开启情况。当模型组大鼠阴门开启数超过50%(33日龄)，停止给药，所有大鼠股动脉放血处死。

1.5 子宫系数、卵巢系数、子宫壁厚度和卵巢黄体生数的测定

大鼠处死后，取子宫和卵巢称湿重，计算子宫和卵巢系数=器官质量(mg)/体质量(g)×100，后甲醛中固定，常规制作组织病理切片，测量子宫壁厚度和卵巢黄体数。

1.6 下丘脑GnRH，Kiss-1和GPR54 mRNA表达水平的测定

1.6.1 下丘脑总RNA的提取

大鼠处死后，冰上迅速取脑组织并分离下丘脑，Trizol法提取下丘脑总RNA，紫外分光光度计测定RNA 浓度和纯度，A260nm/A280nm比值在1.8 ～2.0。

1.6.2 逆转录与PCR扩增

逆转录总反应体系 20μl，42℃反应60 min，70℃ 15 min。PCR扩增总反应体系 25μl，94℃预变性 2 min，94℃ 变性 30 s，58℃ 退火 30 s，72℃延伸30 s。目的基因扩增 30个循环，最后 72℃5 min。

1.6.3 DNA电泳鉴定及图像分析

应用Alpha Innotech FC2型凝胶图像分析软件进行条带积分吸光度分析，用目的基因与β肌动蛋白基因条带积分吸光度(integrated absorbance，IA)比值表示GnRH，GPR54和Kiss-1 mRNA的相对表达水平。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 大补阴丸对真性性早熟大鼠阴门开启时间、子宫和卵巢脏器系数的影响

如表1所示，与正常对照组相比，大鼠处死之日，模型组6只大鼠阴门开启数显著增加(P＜0.01)，子宫系数显著增加(P ＜0.05)，各组大鼠的卵巢系数差异不明显;与模型组相比，大补阴丸3.24 g·kg－1组大鼠阴门开启数显著减少，子宫系数显著降低(P＜0.05)。表明达那唑可促进大鼠子宫和卵巢提前发育，而大补阴丸3.24 g·kg－1组则可延缓子宫的提前发育。

2.2 大补阴丸对真性性早熟大鼠卵巢黄体数和子宫壁厚度的影响

如表2所示，模型组大鼠卵巢黄体数和子宫壁厚度与正常对照组相比均显著增加(P＜0.01);大补阴丸3.24 g·kg－1组卵巢黄体数及大补阴丸3个剂量组子宫壁厚度与模型组相比均显著减少(P＜0.05)，表明达那唑可明显促进幼鼠子宫和卵巢等性器官的发育，大补阴丸具有延缓性早熟发育的作用。

Tab.1 Effect of Dabuyin Wan on vaginal opening，organ coefficients of uterus and ovary of precocious puberty rats

Tab.2 Effect of Dabuyin Wan on the incidence of corpora lutea and uterine wall thickness in precocious puberty rats

2.3 大补阴丸对真性性早熟大鼠下丘脑GnRH，Kiss-1和GPR54基因表达水平的影响

如图1和表3所示，与正常对照组相比，模型组下丘脑GnRH，Kiss-1和GPR54基因表达均显著增加(P ＜0.05);大补阴丸1.62和3.24 g·kg－1降低GnRH mRNA 的表达;而大补阴丸 3.24 g·kg－1降低Kiss-1 mRNA和GPR54 mRNA的表达。

Fig.1 Effect of Dabuyin Wan on mRNA expression of GnRH，Kiss-1 and GPR54 in precocious puberty rats.Lane 1:normal control;lane2:model;lane3:leuprorelin 100 μg·kg－1;lanes4 －6:Dabuyin Wan 3.24，1.62 and 0.81 g·kg－1，respectively.

Tab.3 Effect of Dabuyin Wan on gene expressions of gonadotropin releasing hormone(GnRH)，Kiss-1 and G protein-coupled receptor 54(GPR54)mRNA in hypothalamus of precocious puberty rats

3 讨论

已有研究表明，滋阴泻火合剂对性早熟下丘脑-垂体-性腺轴 (hypothalamic-pituitary-gonad axis，HPGA)功能的异常具有调节作用［3］。正常大鼠青春期启动源于下丘脑GnRH脉冲式分泌的增加［6－7］，GnRH 作用于垂体前叶黄体生成素(luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)分泌细胞上的GnRH受体，促进垂体LH和FSH的分泌，LH和FSH作用于性腺促使卵巢分泌雌二醇及睾丸分泌睾酮，从而促进生殖器官发育及第二性征的出现。本研究选择以模型组大鼠阴门开启数超过本组大鼠数的50%为实验终点，实验结果表明，模型组大鼠子宫系数、子宫壁厚度和卵巢黄体数分别为(154±14)个，(477±71)μm 和(3.1±0.3)个，表明模型组大鼠提前进入青春期。大补阴丸3.24 g·kg－1组子宫系数为 111 ±16，大补阴丸 0.81，1.62 和 3.24 g·kg－1组子宫壁厚度分别为166±27，237±22和(262±22)μm，黄体数均为0个，表明大补阴丸可明显延缓大鼠青春期的启动。

GnRH神经元是机体整合了各种内外环境的刺激后，生殖内分泌体系的最终共同通路［8］。已有研究表明，GPR54是调控青春期发育的关键分子［9－10］，它的内源性配体是由 Kiss-1 基因编码的Kiss神经肽(Kisspeptin)。临床流行病学和动物基因敲除实验研究都发现，GPR54基因的功能缺失性突变或敲除，可导致人或小鼠发生以性发育不良、青春期启动延迟甚至缺失为病理特征的原发性促性腺激素依赖性性腺功能减退症［11］，提示Kiss-1/GPR54的表达与青春期发育密切相关。下丘脑Kiss-1的编码产物Kisspeptin与其受体GPR54结合，刺激Gn-RH神经元，使GnRH脉冲式分泌增加，从而导致生殖系统的发育。这种对于GnRH及其受体的降调节作用，可能是通过下调真性性早熟模型大鼠下丘脑Kiss-1基因表达来实现的，说明Kiss-1基因的转录和GnRH的合成与青春期启动有着密切的关系，但这种降调节的趋势却不完全同步。因为生物基因遗传信息的表达是通过转录、翻译等一系列环节才能使生物体的生理功能得以体现，也就是说，在青春期发育的过程中，基因从转录到翻译是需要一定过程的。虽然所检测的Kiss-1，GnRH和GPR54 mRNA表达处于一个不同步的状态，但结果都显示了大补阴丸对大鼠下丘脑Kiss-1，GnRH和GPR54的降调节作用。

大补阴丸可通过下调下丘脑Kiss-1/GPR54 mRNA的表达，抑制GnRH mRNA及相关蛋白的表达，从而延缓下丘脑-垂体-性腺轴的启动，达到治疗真性性早熟的目的。性早熟发生的机制和大补阴丸对其治疗作用较确切的机制尚待深入研究。

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