纤维蛋白原基因β455G/A、PAI基因4G/5G多态性与下肢深静脉血栓的相关性研究

张秀华，陈云书，侯小华，李桂芹

深静脉血栓形成 (deep vein thrombosis，DVT)和其严重并发症肺血栓栓塞症 (PTE)合称为静脉血栓栓塞症 (VTE)，是医院内常见、高发病，具备高死亡率及可预防的特点。VTE目前已经成为第3位最常见的血管类疾病，其发生率与脑卒中相当。DVT的发生与遗传因素相关，而遗传因素占DVT发病风险因素的60%［1］。其中，凝血与纤溶系统的基因多态性是当前深静脉血栓形成病因学研究的热点。本研究以纤维蛋白原基因及PAI基因作为候选基因，选择多态性位点，探索凝血与纤溶系统基因多态性与DVT形成之间的关系，分析多位点的联合作用对于DVT发生的影响，从而为国人DVT的病因学研究及预防、诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 DVT组:2006年1月—2010年10月就诊于河北省迁安市人民医院呼吸科及普外科的汉族DVT患者共132例，其中男73例，女59例;年龄46～75岁，平均 (63.36±11.77)岁。所有患者经临床查体和下肢静脉超声证实存在下肢深静脉血栓。对照组:同期于河北省迁安市人民医院体检中心的健康体检者155名，其中男87例，女68例;年龄45～78岁，平均 (64.23±12.01)岁。对照组患者均除外心血管疾病、脑血管疾病、高血压病、糖尿病、外周动静脉疾病及恶性肿瘤。DVT组与对照组基线临床资料比较，差异无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及保存 所有研究对象抽取外周静脉血3～5ml，EDTA抗凝，采用酚－氯仿法抽提DNA。保存于－20℃冰箱。

1.2.2 候选基因及研究位点的选择 根据国际上关于凝血与纤溶基因研究的热点，选取纤维蛋白原基因β455G/A、PAI基因4G/5G多态性作为候选研究位点进行分析。

1.2.3 上游引物 Fgβ455G/A:5'－AGAATAGGGTATGAATTTGTTATT－3';下游引物:5'－AATCGTGACTCATTAATGATACCA－3'。PAI基因4G/5G:上游引物:5'－CAGCACACCTCCAACCTCAG－3';下游引物:5'－CCCAACAGAGGACTCTTGGTC－3'。在基因文库 (Genebank)中核对病寻找相应的序列。PCR反应体系为 25μL:STR缓冲液 (包含MgCl2，dNTP，10×缓冲液)2.5μL，上下游引物各2μL，Taq酶0.3μL，模板 DNA1.5μL，ddH2O补充至25μL。PCR 扩增条件:Fgβ455G/A:94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环;最后72℃延伸7min;PAI基因4G/5G:94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃延伸5min。PCR扩增采用PE2400型PCR扩增仪进行。在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中，在80～100V的电压下，0.5%TBE电泳缓冲液中恒压电泳60min(北京六一仪器厂)在透射紫外线平台下观察DNA扩增条带。

1.3 统计学方法 所有资料采用SPSS 12.0统计软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，多因素分析采用Logistic回归分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组间纤维蛋白原基因β455G/A基因型及等位基因频率分布比较纤维蛋白原基因β455G/A多态性AA基因型在DVT组分布频率为7.6%，在对照组为11.3%，差异有统计学意义(P＜0.05)。A等位基因在DVT组分布频率为32.6%，在对照组为24.2%，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表2)。

2.2 两组间PAI基因4G/5G多态性基因型及等位基因频率分布比较 PAI基因4G/5G多态性4G/4G基因型在DVT组分布频率为50.8%，在对照组为34.2%，差异有统计学意义 (P＜0.05)。4G等位基因在DVT组分布频率为71.2%，在对照组为59.3%，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表3)。

2.3 DVT患病的多因素分析 以DVT患病作为因变量进行Logistic回归分析，结果显示年龄、糖尿病史及AA+4G/4G联合基因型为DVT患病的独立危险因素 (P＜0.05)。其中AA+4G/4G联合基因型使DVT患病风险增加136.4% (P＜0.01，见表4)。

表1 研究对象临床资料比较Table 1 Comparison of clinical data of object

表2 两组间纤维蛋白原基因β455G/A基因型及等位基因频率分布比较Table 2 Comparison of beta gene 455G/A genotype and allele frequency distribution between two groups

表3 两组间PAI基因4G/5G多态性基因型及等位基因频率分布比较Table 3 Comparison of the PAI gene 4G/5G polymorphism genotype and allele frequency distribution between two groups

表4 DVT危险因素的Logistic回归分析Table 4 Logistic regression analysis of DVT risk factors

3 讨论

纤维蛋白原 (fibrinogen，Fg)是重要的凝血因子，在凝血、血小板聚集、纤溶调节、动脉硬化的发生发展等诸多方面起着重要的作用。近年来，已见报道10多个Fgβ基因多态性位点，但这些基因多态性是否对血浆纤维蛋白原水平及血栓性疾病是否有影响却存在争议。流行病学资料表明，－455GG纯合子与－455GA型杂合子及－455AA型纯合子相比，GG型个体的血浆Fg水平最低，GA型次之，AA型最高［2］。多项研究表明，Fbβ455G/A 多态性与血栓性疾病的患病相关［3－5］。在本研究中:FGβ448G/A 3种基因型在DVT组与对照组中的分布频率不同，448AA+AG型在DVT组的分布频率高;等位基因在DVT组与对照组中的分布频率也不同，A－448等位基因在DVT组的分布频率高，提示携带A等位基因的人群患DVT的风险增加。而原因可能与携带A等位基因的人群平均Fg水平较高有关。

纤溶功能下降是多种血栓性疾病的重要发病机制之一，纤溶酶原激活剂抑制物 (plasminogen activator inhibitor，PAI)约占纤溶系统抑制物活性的60%，PAI－1是其中最重要的成分。PAI－1基因启动子区存在4G/5G多态性。PAI－1基因4G/5G多态性对调节PAI－1基因的表达有重要作用。4G/5G插入/缺失多态性影响与核蛋白的结合并参与调节PAI－l的基因转录，伴随发生与4G/5G基因型相关的PAI－1合成速率增加并且增加心肌梗死及脑梗死的患病［6－8］。在本研究中，4G/4G基因型及4G等位基因的频率分布在DVT组要显著高于对照组，提示该基因可能通过影响体内纤溶活性及纤维蛋白原的水平从而影响DVT的发病。

国内外研究多局限于对这两个基因多态性分别进行分析，而本研究还将两个凝血与纤溶系统的联合基因型进行了多因素分析。在排除了混杂因素的影响后，AA+4G/4G联合基因型人群患DVT的风险较其他基因型人群增加了136.4%，提示该基因型为DVT患病较强的独立预测因素。这将为今后临床筛查、预防与治疗DVT提供重要参考。针对不同的基因型采取合理干预措施，从而减少DVT的发病。同时，本研究还存在样本量不足等局限，由于AA+4G/5G联合基因型在人群中构成比例偏低，因此，尚需进行更大规模的人群的验证性研究。

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3 Carter AM，Mansfield MW，Stickland MH，et al.Beta－fibrinogen gene－455 G/A polymorphism and fibrinogen levels.Risk factors for coronary artery disease in subjects with NIDDM ［J］.Circulation，2002，106:1938－1942.

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8 Sartori MT，Wiman B，Vettore S，et al.4G/5G polymorphism of PAI－1 gene promoter and fibrinolytic capacity in patients with deep vein thrombosis［J］.Thromb Haemost，1998，80(6):956 －960.