HPLC法测定血浆中左羟丙哌嗪及药代动力学研究

王宝龙，兰 婷，李明华，张俊娜,李穆琼，李晓晔，王玉琨(第四军医大学药学系化学教研室，西安 710032)

HPLC法测定血浆中左羟丙哌嗪及药代动力学研究

王宝龙，兰 婷，李明华，张俊娜,李穆琼，李晓晔，王玉琨(第四军医大学药学系化学教研室，西安 710032)

目的：建立一种简单快速的高效液相色谱法测定左羟丙哌嗪在人血浆中的浓度测定及药代动力学研究方法。方法：以迪马C18(250mm×4.6mm，5μm)为色谱柱，流动相：乙腈∶水(1000ml水加入醋酸2.5ml、三乙胺5ml)=5∶95，流速：1.0m/ml，波长：λex=240nm，λem=350nm，进样量：20 μl，柱温：35℃。结果：20名健康受试者单次口服60mg左羟丙哌嗪片，其t1/2为(1.72±0.64)h，tmax为(0.95±0.24) h，Cmax为(385.68±100.98)ng/ml，AUC(0～12h)为(883.32±245.94)ng/h，AUC(0～∞)为 (939.17±279.51)ng/h。结论：服用该药后，其药动学参数与文献报道基本一致，个体之间、不同年龄、体质量之间无统计学差异(Pgt;0.05)。

左羟丙哌嗪；高效液相色谱法；药代动力学

左羟丙哌嗪是一类具有手性的药物。该药通过对气管、支气管C-纤维外周选择性抑制作用而发挥镇咳作用[1]。其作用部位在神经结后与感觉性神经肽相关的位点。本品镇咳作用强，维持时间长。由于对肾上腺素受体、M胆碱受体和阿片受体均无明显作用，因此其中枢抑制的不良反应较少[2]。口服左羟丙哌嗪吸收迅速，主要分布在支气管肺部。本品在体内被广泛代谢。35%原型和代谢产物在口服48h内从尿排出。主要用于由上呼吸道感染、咽炎、间质性肺炎、支气管哮喘和支气管炎等呼吸疾病引起的干咳和持续性咳嗽。

迄今报道的测定左羟丙哌嗪的方法有HPLC-UV法[3-4]、流动注射发光法[5-6]、RF-HPLC法[7-9]。本试验在以上荧光法的基础上进行了条件优化，旨在建立测定血浆中左羟丙哌嗪的方法，并对其药代动力学参数进行测定。

1 仪器与试药

1.1仪器

日本岛津高效液相色谱仪(型号LC-20AT)，荧光检测器(型号RF-10AXL)。

1.2试剂

左羟丙哌嗪分散片(生产厂家：昆明源瑞制药有限公司，规格：60mg/片，批号：20091201)，甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾为pH基准试剂。

2 方 法

2.1对照品溶液的配制

精密称取左羟丙哌嗪5mg，置于50ml量瓶中，用甲醇溶解并定容再续取左羟丙哌嗪1ml，置于10ml量瓶中，用甲醇定容得到10μg/ml的左羟丙哌嗪贮备液。

2.2受试者的选择

随机选择男性健康受试者20名，年龄(35.3±3.0)岁，身高(169.8±2.9)cm，体质量(61.8±2.9)kg。试验前经病史询问、体检、胸透、心电图、血及尿常规、血生化检查，各项指标均正常，受试者无药物过敏史和药物依赖史，无精神病史及其他慢性病史。受试前2周及试验期间未服用任何药物，受试期间禁烟、酒及其他含咖啡因、茶碱等饮料，避免剧烈运动。所有受试者自愿参加试验并签署知情同意书，试验方案经伦理委员会批准。

2.3给药方法

左羟丙哌嗪正常临床治疗剂量为一次口服60mg，3次/d。鉴于国内文献报道多采用单剂量口服左羟丙哌嗪60mg，为便于与文献比较，故本试验左羟丙哌嗪的给药剂量确定为单次口服60mg。

2.4采集血样

受试者禁食12h后，早晨空腹给药，用温开水250ml吞服药物，服药后4h进统一食谱的标准餐。口服药物前抽取空白血样5ml，在服药后的10、20、30、45min，1、1.5、2、3、4、6、8h和12h分别采静脉血5ml，置无菌肝素抗凝的试管中，离心分离出血浆置无菌试管中，于-20℃保存。

2.5血药浓度测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱：迪马C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈∶水(1000ml加入醋酸2.5ml、三乙胺5ml)=5∶95，流速：1.0ml/ml，波长：λex=240nm，λem=350nm，进样量：20μl，柱温：35℃。

2.5.2 血浆样品处理 取样品血浆1ml置于10ml具塞玻璃离心管中，然后精密加入1mol/L的K2HPO4(pH=8.9) 1.0ml，混合后加入二氯甲烷-乙醚(7∶3) 7ml，涡旋混合3min，离心5min(3000rpm)。取上层有机层，用氮气吹干，残渣用0.4ml蒸馏水溶解并进样。

2.6特异性考察

左羟丙哌嗪对照品、空白血浆、空白血浆加对照品、血浆样品色谱图见图1，左羟丙哌嗪的保留时间大约为11.7min，分离度良好，可确保分析方法的专一性。

图1 左羟丙哌嗪色谱图

2.7标准曲线的制备

取1ml空白血浆共9份，依次加入左羟丙哌嗪储备液0、1、2、5、10、20、40、80μl和100μl制成0、10、20、50、100、200、400、800ng/ml和1000ng/ml的血浆样品，按2.5.2项下操作，进样分析，以药物峰面积为纵坐标(y)，血药质量浓度(x)为横坐标作回归分析，得回归方程：y= 4044.519x+ 85623.377 (r=0.9989)。结果表明，在10～1000ng/ml线性范围内，左羟丙哌嗪线性关系良好，按该方法测得的左羟丙哌嗪的血药质量浓度的检测限为2ng/ml，最低定量限为10ng/ml。

2.8稳定性实验

取离心管数支，精密加入1ml空白血浆，再分别精密加入不同量的左羟丙哌嗪溶液，涡旋混匀，配成质量浓度为20、200ng/ml和800ng/ml的左羟丙哌嗪血浆若干份，取上述质量浓度样品，分别考察室温和-80℃冰冻保存30d及反复冻融之后的稳定性。结果表明，经过室温放置，-80℃冰冻保存30d及反复冻融之后，左羟丙哌嗪的浓度基本无变化，RSD值均小于4.2%。

2.9精密度实验

离心管数支，于离心管中分别精密加入不同量的左羟丙哌嗪标准液适量，涡旋混匀，配成20、200ng/ml和800ng/ml的左羟丙哌嗪标准含药血浆样品，每个质量浓度做5份样品，每次做一批并随行标准曲线，按2.5.2项下操作；连续分析三批，记录左羟丙哌嗪峰面积(y)，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，测得三个质量浓度的批内精密度RSD值分别为4.73%、3.28%、1.46%，批间精密度RSD值分别为4.98%、3.10%、4.26%，结果表明，本实验的分析方法精密度良好。

2.10提取率实验

取离心管数支，于离心管中分别精密加入不同量的左羟丙哌嗪对照液，精密加入1ml流动相，涡旋混匀，配成含左羟丙哌嗪质量浓度分别为20、200ng/ml和800ng/ml的溶液，按2.5.2项下操作，每种浓度做5份样品，记录左羟丙哌嗪峰面积(ys)。

取离心管数支，于离心管中分别精密加入不同量的左羟丙哌嗪标准液适量，精密加入1ml空白血浆，涡旋均匀，配成20、200、800ng/ml的左羟丙哌嗪血浆样品，按2.5.2项下操作，每种浓度做5份样品。记录色谱图，记录峰面积yi，yi和ys之比即为左羟丙哌嗪的提取率。结果表明，本分析方法的平均提取率大于85%，能作为实验用的提取方法。

3 结 果

图2 健康受试者口服左羟丙哌嗪后的平均血药浓度时间曲线图

3.1血药浓度测试结果

受试者血浆样品按2.5.2项下操作，每批样品测定之前均随行标曲，并在测定时随机分配含左羟丙哌嗪质量浓度为20、200ng/ml和800ng/ml的质控样品，计算样品和质控样品的浓度，根据质控样品的测定结果决定当日数据的取舍，受试者的平均血药浓度-时间曲线见图2。

3.2药动学结果

将受试者的经时血药浓度录入DAS(ver2.0.1)程序计算。20名健康受试者口服左羟丙哌嗪后，其消除半衰期t1/2为 (1.72±0.64)h，tmax为(0.95±0.24) h，Cmax为 (385.68±100.98)ng/ml，AUC(0～12h)为 (883.32±245.94)ng/h，AUC(0～∞)为 (939.17±279.51)ng/h。

4 讨 论

我们考察了不同流动相对左羟丙哌嗪出峰时间的影响，发现流动相中磷酸盐缓冲液浓度的微小变化对样品出峰时间影响较大，经过多次平行实验，最终确定用文中所述的流动相组成，这样既保证了样品能在12min之前出峰，缩短测试时间，又尽可能的减少有机相的用量，减少对环境的污染。

在处理血浆方面，之前有文献报道用三氯甲烷∶异丙醇=9∶1[7-8]，三氯甲烷[9]作为萃取液提取血浆中的左羟丙哌嗪，但以上方法均要用到毒性较大的三氯甲烷，而我们采用了毒性较小的二氯甲烷，又加入一定量的乙醚作为萃取液，该萃取液体系对左羟丙哌嗪的提取效果好，提取率高，且在萃取时处在血浆的上方，使得进行实验更加方便且污染较小。

在选择检测方法方面，我们先选取了紫外法测定左羟丙哌嗪的浓度，在实验中发现，在其最大吸收波长240nm处其吸收比较弱，用此方法检测的灵敏度低，造成的测量误差大。最后经过筛选，决定用荧光法对其进行测定，减少了血浆中杂质的干扰，从而提高了左羟丙哌嗪检测的灵敏度与准确性。

本实验建立了RF-HPLC法测定左羟丙哌嗪片剂的方法，并测试了该药的药动学参数。实验结果表明该方法分离度高，选择性好，样品在-80℃冰冻保存条件下可放置30d，提取回收率大于85%，方法成熟、完善，均有较高的专属性，可用于左羟丙哌嗪的临床研究工作。

[1]冯琳. KMnO4-HCHO-EDTA流动注射化学发光法测定左羟丙哌嗪[J].江西师范大学学报：自然科学版， 2009，33(3)：279-281.

[2]席志军，章竹君，孙永华. 高效液相色谱化学发光法测定血清中左羟丙哌嗪[J].分析试验室，2009，28(5)：16-19.

[3]鄢琳，李铜铃，张蓉琴，等. RP-HPLC测定左羟丙哌嗪缓释片的含量[J].中国药学杂志，2004，39(4)：303-304.

[4]吕荆洪,赵亚萍．HPLC法测定 LOD糖浆的含量[J].中国药师，2002，5 (1)：35-36．

[5]李丽，黄玉明. 流动注射化学发光法测定左羟丙哌嗪[J].西南师范大学学报：自然科学版，2006，31(6)：169-172.

[6]李丽，郑奎玲. Ce(SO4)2-罗丹明6G-左羟丙哌嗪化学发光体系的研究[J].贵州师范大学学报：自然科学版，2007，25(2)：100-102.

[7]朱运贵，肖轶雯，雷志强. 左羟丙哌嗪的人体药动学研究[J].医学临床研究，2005，22(11)：1578-1581.

[8]刘金玲. HPLC荧光法研究左羟丙哌嗪的人体药动学[J].湖南师范大学学报：医学版，2006，3(2)：42-45.

[9]高洪志，梁宇光，郝光涛，等. 左羟丙哌嗪含片人体药动学研究[J].中国新药杂志，2008，17(16)：1443-1447.

[编辑] 一 凡

R914

A

1673-1409(2012)04-R058-04

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.04.030

2012-03-10

国家自然科学基金资助项目(21172261，21042008)。

王宝龙(1984-)，男，陕西西安人，助教，主要从事药物合成与分析研究；通讯作者：王玉琨，E-mail：wangyk@fmmu.edu.cn。