大鼠脑挫伤后碱性成纤维细胞生长因子的表达变化与损伤时间的推断研究

贾美娟 梁新华 焦 炎

山西医科大学法医学院，山西太原 030001

大鼠脑挫伤后碱性成纤维细胞生长因子的表达变化与损伤时间的推断研究

贾美娟 梁新华 焦 炎

山西医科大学法医学院，山西太原 030001

目的 研究大鼠脑挫伤后脑组织中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）时序性表达的规律，探讨bFGF的表达与脑损伤经过时间的关系，旨在为法医实践中推断早期脑损伤时间提供科学依据。 方法 参照Feeney′s法建立SD大鼠脑损伤模型，每组8只将实验动物（n=64）随机分为8个组（7个实验组，1个对照组），其中实验组依据损伤时间的不同分为 1、6、12 h、1、2、3、7 d 共 7 个亚组。应用免疫组化（SABC）法及免疫印迹（Western blot）法检测大鼠脑组织bFGF的含量。 结果 脑挫伤后6 h阳性细胞数逐渐增多，3 d达峰值，7 d已开始下降，但仍高于基础水平。 结论挫伤后脑组织中bFGF的表达呈现出一定的时序性规律，为早期脑损伤时间的推断提供了实验依据。

法医学；bFGF；损伤时间；免疫印迹法；SABC

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）属于成纤维细胞生长因子家族，是一种存在广泛的多功能肽类生长因子，在细胞的转化、增殖、分化和细胞生长周期中发挥着重要的作用[1]。bFGF广泛存在于中枢及外周神经系统中，对神经组织具有生长分化、维持存活的作用，是有效的神经营养因子之一。本文采用自由落体装置建立大鼠脑挫伤模型，联合采用免疫组化（SABC）法及免疫印迹（Western blot）法两种方法检测该模型中脑挫伤后不同时间段大鼠脑组织中bFGF含量的变化，探讨脑挫伤后bFGF表达的变化与时间的关联性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

从山西医科大学实验动物中心购入健康成年SD大鼠64只，体重为250 g左右，雌雄均可，随机分为8组（7个实验组和1个对照组），其中实验组依据损伤时间不同随机命名为 1 h组、6 h组、12 h组、1 d组、2 d组、3 d组、7 d组。

1.2 脑挫伤模型的建立及取材

应用自由落体打击装置建立脑挫伤模型（参照Feeney′s法[2]）。首先动物称重后，腹腔注射4%戊巴比妥（30 mg/kg）进行麻醉，后应用大鼠脑立体定位仪将实验动物固定于手术台，头顶部去毛备皮，酒精消毒后，于顶部正中纵形切口，开直径为4 mm的圆形骨窗（颅骨中线旁2 mm、人字缝前方3 mm处），手术成功完成后，选取40 g铁质砝码模拟重锤从30 cm高处自由落体打击手术中暴露的脑组织，肉眼见损伤处脑组织略微肿胀隆起，轻微出血。对照组动物行假手术处理，但不受打击。对照组和脑损伤组大鼠术后均常规喂养。脑损伤组动物分别于伤后 1、6、12 h、1、2、3、7 d 剪头并取出脑组织，于脑损伤部位取材，后在4%多聚甲醛PBS液中固定24 h，后行免疫组织化学染色；另取脑挫伤灶组织100 mg液氮中保存，备用于蛋白提取。对照组大鼠取材及组织处理同脑损伤组大鼠。

1.3 方法

1.3.1 SABC染色法 4%多聚甲醛PBS固定液中取出脑组织，常规包埋切片（厚度5 μm），具体步骤参照试剂盒说明书进行。①3%H2O2孵育灭活内源性过氧化物酶，用PBS液充分冲洗。②滴加山羊血清1～2滴，37℃下孵育20 min后倾去。③滴加经稀释为1∶100的一抗，过夜后PBS冲洗。④滴加二抗，37℃孵育3 min，PBS液冲洗2次。⑤滴加SABC工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗。⑥镜下显色，观察结果。⑦蒸馏水淋洗终止显色，经苏木精复染后封片，观察结果。注意对照组以PBS代替一抗作阴性对照，其余步骤与实验组相同。运用图像分析系统分析，以损伤区及其周围的星形胶质细胞或小胶质细胞细胞核出现棕黄色的颗粒状物为阳性反应，并计数阳性细胞数。

1.3.2 Western blot法 取出备用的脑组织，称取100 mg尽量剪碎后匀浆，抽取1 mL加入蛋白裂解液2 mL，离心去上清，加入3%SDS，封口，沸水中加入变性。随后进行蛋白定量，配制SDS-PAGE凝胶进行电泳。随后转膜1 h（100 V，350 mA），在转印的醋酸纤维素膜上分别加FGFR1抗体4℃，过夜。用TBST冲洗3次，每次5 min。加1∶3 000稀释的FGFR1温孵育2 h，再用TBST冲洗3次，每次5 min，发光并显色（全自动显影系统型号：柯达KADOK Image station440）。bFGF的相对含量用条带积分光密度值（integrate optical density，IOD）来表示。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 13.0及Image-Pro Plus 6.0分析统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行方差分析及q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化SABC染色结果

对照组大脑皮层偶见散在的阳性反应，阳性物质位于星形胶质细胞和小胶质细胞的细胞核。脑挫伤后6 h阳性细胞数开始增多，3 d达峰值，7 d已开始下降，但阳性细胞数仍多于对照组，见图1。高度统计学意义（P<0.001）。伤后6 h阳性细胞计数较对照组显著增多（P<0.05）。伤后3 d组bFGF阳性细胞计数达到高峰，随后表达降低，但伤后7 d仍维持在较高水平。

表1 大鼠脑挫伤后不同时段bFGF阳性细胞计数（±s）

表1 大鼠脑挫伤后不同时段bFGF阳性细胞计数（±s）

注：与对照组比较，*P<0.001；与前一组比较，#P＜0.001

组别例数 阳性细胞数对照组1 h组6 h组12 h组1 d组2 d组3 d组7 d组8 8 8 8 8 8 8 8 8.20±0.45 9.80±0.781 13.25±0.45*#27.44±0.22*#42.44±0.23*#47.60±0.25*50.44±0.44*14.42±0.26*

2.2 Western blot结果

应用Western blot检测法检测见，损伤组6 h组条带已经比较清晰，且明显宽于1 h组，12 h组又进一步增宽，1 d组、2 d组条带与3 d组宽度最宽，7 d组已明显变窄，但是仍比对照组宽。见图2。

运用图像分析系统（BI-2000），镜下观察（×400），以损伤部位周围神经元及各类胶质细胞（主要为星形胶质细胞和小胶质细胞）的细胞核或胞浆内出现棕黄色颗粒状产物为阳性，并计数阳性细胞数，见表1。

由表1数据可以看出，各损伤组bFGF阳性细胞计数与对照组比较，除1 h组外其余各组与对照组比较，差异均有

以IOD值作为相对含量，见脑挫伤后1 h组与假手术对照组比较略有增高，6 h表达开始增多，3 d达到高峰，随后下降，至7 d时仍高于对照组水平。经统计学分析，除1 h组外不同时间段各损伤组与对照组比较均有统计学意义（P<0.05）。任意两实验组之间两两比较，除1、2、3 d组间差异无统计学差异（P>0.05）外，其余各组组间差异均有统计学意义（P<0.05）。 见表 2。

表2 大鼠脑挫伤后不同时段bFGF的IOD值（±s）

表2 大鼠脑挫伤后不同时段bFGF的IOD值（±s）

注：与对照组比较，#P<0.05；与前一组比较，*P<0.05

组别例数IOD值对照组1 h组6 h组12 h组1 d组2 d组3 d组7 d组8 8 8 8 8 8 8 8 14 727.18±355.746 17 959.30±2 013.615 31 397.61±2 159.613#*42 343.77±1 119.144#*56 170.83±2 877.773#55 259.44±1 911.650#58 499.06±994.989#22 889.43±2 754.905#

3 讨论

颅脑损伤在意外、交通事故以及暴力性损伤中居首位，对于该损伤的早期时间的推断也一直成为法医学界的热点问题。据有关研究表明，大脑组织挫伤后，较易形成脑组织局部缺血缺氧，从而导致细胞内环境的生物化学性质发生改变，进而引发了一系列应激反应[3-5]，许多细胞因子及生物活性物质均参与了脑损伤后的修复过程。据Finklestein等[6]研究，脑损伤后，bFGF的表达和分布具有一定的规律性和特征性变化。bFGF作为多肽神经生长因子和促分裂因子，在脑组织中广泛分布，可能与神经的营养再生、创伤愈合等密切相关，能保护神经元对抗损害，可以防治及减少神经元的继发性损伤，使病理状态的神经元生存，而修复的神经元又可以产生很多的神经营养因子，进而加快脑损伤后的修复过程，这可能就是bFGF在脑损伤后早期表达的意义。正常的中枢神经系统中bFGF主要来自星形胶质细胞（astrocyte，AS）。平时脑组织中含有较低含量的bFGF，其主要作用是维持中枢神经系统的正常功能并延缓细胞老化[7]。

本研究中采用SABC法及Western blot法检测大鼠脑挫伤后不同时段脑组织中bFGF的含量，探讨bFGF在脑挫伤发生发展中的动态变化规律。结果显示两种方法的实验结果相吻合，均表现出先逐渐升高，达到峰值后又逐渐下降的趋势，即bFGF在脑组织中的表达伤后6 h开始增多，3 d达峰值，7 d已开始下降，但仍高于对照组。该结果表明大鼠脑挫伤后6 h表达开始逐渐增多，24 h表达进一步加强，3 d达到峰值，然后开始下降，到7 d时仍未恢复正常。BFGF在脑挫伤后的表达呈现一定的规律性，在脑损伤后6 h表达明显增强，3 d达高峰，随后即下降，这种趋势估计与它的生物学效应有关。由于bFGF是通过其受体才能发挥作用的，而bFGF受体是一种双重受体系统：即低亲和力受体和高亲和力受体两种。其机制为bFGF须先与低亲和力受体结合，构型改变后才能与高亲和力受体结合，激活高亲和力受体的内源性酪氨酸激酶的活性，促进受体及其底物磷酸化，完成细胞外信息向胞内的传递，从而使其发挥生物学作用[8]，所以在脑挫伤后的6 h内表达不明显，后随着时间延长，低亲和力受体在这段时间内充分改变构型与高亲和力受体结合，使其在之后的时间表达明显增加。这种受体学说与本实验中bFGF的表达趋势吻合。本实验证实了bFGF参与脑损伤后的修复过程，并与脑挫伤经过时间有一定的关联性，可见机体对脑损伤存在自身的保护机制，其表达的时序性的改变有望用于法医鉴定中对于脑损伤经历时间的推断。本文只是对大鼠进行了脑挫伤后不同时段脑组织中bFGF的含量变化的初步研究，为今后法医学中损伤时间推断提供了一定的依据。此外可与其他一些敏感指标联合判断、综合分析，从而更加准确地推断早期的脑损伤时间。

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The inference study on the change of the expression of basic fibroblast growth factor and the time after brain contusion in rats

JIA Meijuan LIANG Xinhua JIAO Yan
School of Law Medicine,Shanxi Medical University,Shanxi Province,Taiyuan 030001,China

Objective To study the temporality expression rule of basic fibroblast growth factor after brain contusion in rats,and to investigate the relationship between the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF)and the time after brain contusion,in order to provide scientific evidence for practice of legal medicine to conclude the time of inchoate brain contusion.Methods 64 adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 8 groups(7 of experiment groups and 1 of control group).The rats in experiment group were divided into 7 groups after contusion injury which was performed by the drop method with Feeney's way:1 h group,6 h group,12 h group,1 d group,2 d group,3 d group,7 d group.Immunohistochemistry and Western blot were used to study the expression levels of bFGF in brain tissue of rats.Results Positive cells increased at 6 hours after brain injury,the most prominent was at third days after contusion injury,and decreased at 7 days after brain injury,but it was more than basal levels.Conclusion There is temporality regular between the expression of bFGF and the time after brain contusion in rats,this regularity can provide experiment evidence for practice of legal medicine to conclude the time of inchoate brain contusion.

Legal medicine;bFGF;The time of brain contusion;Western blot;SABC

R318

A

1673-7210（2012）08（b）-0016-03

贾美娟（1984-），女，汉族，山西长治人，硕士研究生；研究方向：临床法医学。

焦炎，男，汉族，山西太原人，医学博士，教授，博士生导师，主要从事临床法医学的教学、研究和检案工作。

2012-03-02 本文编辑：卫 轲）