氨溴特罗口服溶液微生物限度检查方法学验证

陈扣宝 王 玮

（巢湖市食品药品监督检验所，安徽 巢湖 238000）

氨溴特罗口服溶液具有止咳祛痰的新药，其主要成分为盐酸氨溴索和盐酸克仑特罗。根据《中国药典》2010年版的规定，药品在进行微生物限度检查前必须对其检查方法进行验证，以确认供试品所采用的检查方法无抑菌作用后再进行检查，才能真实反映供试品受污染的程度。因此，我们对氨溴特罗口服溶液进行了微生物限度检查的方法验证。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

净化工作台、托盘天平、HTY-761匀浆仪、HTY-ⅢA集菌仪（杭州高德泰林有限公司）、开放式薄膜过滤器（杭州高德泰林有限公司）、BIO-Ⅱ-A2生物安全柜（上海振梓空气净化设备有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械一厂）、YQL-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器、MJX-160B-Z霉菌培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）

1.2 培养基

营养肉汤培养基、改良马丁液体培养基、改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基等均由中国药品生物制品检定所提供。稀释剂：pH 7.0蛋白胨-氯化钠缓冲液（稀释供试品用，中国药品生物制品检定所提供），靛基质试液由本实验室提供。

1.3 供试品

氨溴特罗口服溶液（规格：100mL/瓶，生产厂家：市售，批号：101126、101127、101128）

1.4 试验菌

大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法和结果

按中国药典2010年版二部附录Ⅺ J有关微生物检查方法验证试验[1,2]。

2.1 菌液的制备

2.2 供试液制备

取10mL供试品，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100mL，用匀浆仪（2000r/min，2min）混匀，作为1:10倍的供试液备用。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.3.1 试验组

取1:10倍供试液1mL和1mL已制备好的菌液，注入同一平皿，迅速倒入15～20mL 45℃的相应琼脂培养基，待凝，每个菌株制备2个平皿。细菌在30～35℃培养箱中培养48h～72h；霉菌在23～28℃培养箱中培养72～120h，逐日观察，点计菌落数，取均值。

2.3.2 菌液组

分别取菌液1mL注入平皿内，每种菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组

按试验组方法，不加菌液，测定供试品菌数（本底菌）。

2.3.4 稀释剂对照组

取与供试液等量的稀释剂和菌悬液各1mL注入一个平皿中，平行做2份，培养基注皿，培养，计数，取均值。

2.3.5 回收率测定

按下列公式：

（以下同）计算回收率，

（以下同）计算回收率，

常规法的回收率结果见表1。

从表1结果看，采用常规法检查供试品，5种菌株的回收率均大于70%，因此可以采用常规法对该药品细菌、霉菌和酵母菌进行计数检查。

表1 常规法的回收率试验结果（%）

2.4 控制菌（大肠埃希菌）检查方法的验证

2.4.1 供试液的制备

同“2.2”项下1∶10供试液的制备。

2.4.2 试验组

①常规法：取1:10的供试液10mL和大肠埃希菌悬液1mL（约为50～100cfu/mL）接种至100mL胆盐乳糖培养基中，置于35℃培养18～24h，取0.2mL接种至5mLMUG培养基管内，35℃培养，分别于5h与24h的时间，置366nm紫外光下观察荧光，再沿培养管管壁加入数滴靛基质试液，观察结果。 同时用未接种的MUG培养基作本底对照。 ②培养基稀释法 取1:10的供试液10mL和大肠埃希菌悬液1mL（约为50～100cfu/mL）接种至400mL胆盐乳糖培养基中，置于35℃培养18～24h，取0.2mL接种至5mLMUG培养基管内，35℃培养，分别于5h与24h的时间，置366nm紫外光下观察荧光，再沿培养管管壁加入数滴靛基质试液，观察结果。同时用未接种的MUG培养基作本底对照。③薄膜过滤法 取1∶10的供试液10mL加入到已灭菌的反复使用全封闭薄膜过滤器中，过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液400mL冲洗（100mL/次，冲洗4次），在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌悬液1mL（约为50～100cfu/mL），取出滤膜接种至100mL胆盐乳糖培养基中，置于35℃培养18～24h，取0.2mL接种至5mLMUG培养基管内，35℃培养，分别于5h与24h的时间，置366nm紫外光下观察荧光，再沿培养管管壁加入数滴靛基质试液，观察结果。同时用未接种的MUG培养基作本底对照。

2.4.3 阴性对照

取稀释剂10mL取代供试液，其余照试验组操作。

2.4.4 阳性对照

不加供试液，其余照试验组操作。

2.4.5 供试品组

取供试液10mL，不加菌，其余照试验组操作。

2.4.6 结果见表2。

表2 大肠埃希菌控制菌验证方法试验结果

从表2结果看，采用薄膜过滤法，阴性对照、供试品组未检出试验菌，阳性对照检出试验菌，试验组检出试验菌，说明可采用薄膜过滤法（400mL冲洗，100mL/次）对该供试品进行控制菌检查。

3 讨 论

3.1 试验结果表明，氨溴特罗口服溶液可采用平皿法进行细菌数、霉菌和酵母菌数检查，控制菌（大肠埃希菌）可采用薄膜过滤法（400mL冲洗，100mL/次）进行检查。

3.2 在该验证方案中有值得我们思考和研究之处

在细菌计数方法验证时，我们针对大肠埃希菌的回收率的3次独立试验中，回收率均高于90%，表明该药物对大肠埃希菌是没有抑菌作用。但是，在控制菌（大肠埃希菌）检查验证试验中，当我们采取常规法试验时，试验组在规定条件培养后，产酸产气不明显，MUG荧光与阳性对照比较时较弱，靛基质试验中变色不明显；我们又用了培养基稀释法，结果同常规法基本一致；最后通过验证，我们采取薄膜过滤法（400mL冲洗，100mL/次）进行检查，结果符合要求。从控制菌验证试验我们看出该药物对大肠埃希菌是有抑制作用的，从这个角度分析，这与细菌验证时的作用是相互矛盾。我们分析其原因：两种试验中唯一的区别在于培养基的差异，细菌计数采用营养琼脂、控制菌检查采用的是胆盐乳糖液体培养基，因此我们认为培养基可能对药物的菌落加样回收具有不可消除作用。因此，我们在做微生物限度验证试验时应更加仔细，认真考虑所有的影响因素，勤比较、细观察、多总结。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典二部[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社,2010:附录107.

[2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范.2010年版.北京:中国医药科技出版社,2010:40-389.