Calpain抑制剂ALLN对酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠的镇痛作用及其对脊髓背角环氧化酶-2表达水平的影响

王静捷，陈广俊，陈 雯，杜 金，罗爱伦，黄宇光

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院麻醉科，北京100730

2江苏省苏北人民医院麻醉科，江苏扬州225001

Calpain是一类钙离子依赖半胱氨酸蛋白酶，参与许多生理和病理过程，包括神经塑形［1］和神经细胞死亡［2］。外周组织炎性损伤后会引起脊髓背角神经细胞内Ca2+浓度增加，进而可能引起calpain活化。活化后的calpain通过其限制性蛋白水解作用参与细胞内许多受钙离子调节的信号通路，改变这些特异性底物蛋白的功能或促进其降解。有研究表明，伤害性神经元敏化过程中calpain被活化［3］。本研究旨在采用酵母多糖足底炎性疼痛大鼠模型，评价模型大鼠的疼痛行为学、炎性水肿程度以及脊髓背角calpain的活化情况;并通过calpain抑制剂ALLN干预模型大鼠，观察其镇痛作用和对脊髓背角环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表达的影响，探讨calpain在炎性疼痛中的作用机制。

材料和方法

动物及分组处理

疼痛模型的建立:SD大鼠48只，6周龄，雄性，体重160～200 g。随机分为3组:对照组 (n=8)、假手术组 (n=16，其中8只于制模后4 h处死取腰段脊髓背角组织，余下8只进行疼痛行为学测定及左侧后足最大厚度测量)和酵母多糖组 (n=24，分别于制模后4、24、48 h进行疼痛行为学测定及左侧后足最大厚度测量，每个时间点测量结束后处死8只)。按Meller等［4］方法，通过在大鼠左侧后足足底皮下注射酵母多糖1.25 mg制作酵母多糖足底炎性疼痛模型。假手术组大鼠在左侧后足足底皮下注射同等容积的PBS。各组大鼠在制模前及制模结束后0.5、1、2、4、8、24、48 h进行机械刺激缩足阈值 (mechanical withdrawal threshold，MWT)和左侧后足足底最大厚度测量。并于上述相应时间点处死取腰段脊髓背角进行Western印迹分析，测定calpain活化水平。

ALLN干预实验:SD大鼠64只，6周龄，雄性，体重160～200 g，随机分为3组。假手术组 (n=16):足底注射PBS 100 μl。其中8只于假手术前、假手术后0.5、1、2、4、8、24、48 h测定MWT和左侧后足足底最大厚度;余下8只于假手术后4 h处死。二甲基亚砜 (dimethyl sulphoxide，DMSO)溶剂对照组 (Z+V组，n=24):腹腔注射2 ml/kg的溶剂DMSO(与Z+A组注射ALLN 20mg/kg所需DMSO的体积相同)，30 min后足底注射酵母多糖 1.25 mg制模。于制模前、制模后0.5、1、2、4、8、24、48 h测定MWT和左侧后足最大厚度，并分别于制模后4、24、48 h，每个时间点处死8只。ALLN治疗组(Z+A组，n=24):腹腔注射剂量为20 mg/kg的ALLN注射液，30 min后足底注射酵母多糖1.25 mg制模。于制模前、制模后0.5、1、2、4、8、24、48 h测定MWT和左侧后足最大厚度，并分别于制模后4、24、48 h处死大鼠，每个时间点处死8只。各组于上述相应时间点处死的大鼠均取腰段脊髓背角进行Western印迹分析，测定COX-2表达水平。

酵母多糖及ALLN注射液配制1.25 mg酵母多糖 (Sigma)溶解于100 μl PBS中，配制酵母多糖注射液。10 mg ALLN(Calbiochem)溶解于1 ml的有机溶液DMSO中，配制ALLN注射液，使其浓度为10 μg/μl， -20℃ 保存。

MWT测定在安静的环境，将大鼠放在金属丝网眼垫上，用透明塑料鼠笼约束大鼠，适应15 min后，采用电子von Fray压力测痛仪 (Life Science)轻轻触压大鼠左侧后足第3、4趾间的皮肤，缓慢增加压力，直至大鼠左侧后足抬起，记录抬足时的压力数值。如此重复测量3次，取平均值为其MWT。

左侧后足足底最大厚度测量在MWT测量完毕之后，将大鼠置于塑料瓶中，待其安静后，固定其左足，使用电子数显卡尺 (0～100 mm)测量左侧后足足底最大厚度 (腹侧至背侧)，以评价其炎性水肿程度。

Western印迹方法测定腰段脊髓背角calpain活化和COX-2表达水平大鼠分别在上述指定时间点经乙醚麻醉、断头处死后，提取腰段脊髓背角。大鼠采取俯卧位，剪去背部毛发，常规消毒，铺巾，沿棘突切开皮肤及皮下组织，用咬骨钳分别咬去棘突、椎板，暴露脊髓，小心取出L4-6脊髓，冰上操作(并保持无菌)，迅速切除制模侧腰段脊髓背角，立即放入液氮保存。提取总蛋白时将脊髓背角放在匀浆器中，在裂解液中充分匀浆 (始终在冰浴中进行)。匀浆好的标本取出放入离心管中4℃摇床60 min。然后将匀浆好的标本经低温高速 (4℃，12 000×g)离心30 min，取上清液。分装标本-80℃保存。使用Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concerntrate进行蛋白定量，通过Western印迹方法分别检测spectrin αⅡ降解产物 (breakdown products，BDP)的含量变化(calpain活化后会降解spectrin αⅡ，生成相对分子质量为145 000和150 000的片段，通过对该条带的检测可以反映calpain的活化程度)及COX-2表达水平变化。抗体使用鼠抗 spectrin αⅡ抗体 (Millipore)、兔抗 COX-2抗体 (Santa Cruz Biotechnology，Inc.)和鼠抗 β-actin抗体 (Sigma)。采用 Bandscan软件对Western印迹条带进行灰度分析。

统计学处理采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析和Post Hoc检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

对照组、假手术组和酵母多糖组大鼠MWT组间MWT基础值差异无统计学意义 (P＞0.05)。对照组和假手术组大鼠制模侧后足均未出现明显的机械痛敏。酵母多糖组大鼠在制模后0.5、1、2、4、8、24、48 h制模侧后足对机械性刺激的敏感性增强，与对照组和假手术组相比MWT明显降低 (P＜0.05)(表1)。

表1 制模后各时间点对照组、假手术组和酵母多糖组大鼠机械刺激缩足阈值比较 (±s，g)Table 1 Mechanical withdrawal threshold of zymosan-induced inflammatory pain rats compared with control and sham-operated groups at different time points after the surgery(±s，g)

表1 制模后各时间点对照组、假手术组和酵母多糖组大鼠机械刺激缩足阈值比较 (±s，g)Table 1 Mechanical withdrawal threshold of zymosan-induced inflammatory pain rats compared with control and sham-operated groups at different time points after the surgery(±s，g)

与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01;与假手术组比较，cP＜0.05，dP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group;cP ＜0.05，dP ＜0.01 compared with sham-operated group

组别Group 0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h对照组Control group 54.95±3.18 51.98±6.35 54.00±0.85 54.30±3.11 52.95± 0.78 50.05±0.64 52.75± 1.20 53.10±4.24假手术组Sham-operated group 53.20±1.56 47.93±8.73 48.13±4.07 49.68±2.83 55.53±10.25 49.85±9.47 50.10±10.75 56.03±4.29酵母多糖组Zymosan group 55.00±3.11 37.48±4.99bc39.78±5.56bc31.08±5.07bd16.45± 9.74bd29.10±6.71ad29.53± 3.80bd33.55±3.51bd

对照组、假手术组和酵母多糖组大鼠左侧后足足底最大厚度组间左侧后足足底最大厚度基础值差异无统计学意义 (P＞0.05)。对照组和假手术组大鼠左侧后足足底最大厚度均未发生明显变化。酵母多糖组大鼠在制模后0.5、1、2、4、8、24、48 h左侧后足足底最大厚度明显增加，与对照组和假手术组相比差异均有统计学意义 (P＜0.01)(表2)。

对照组、假手术组和酵母多糖组大鼠腰段脊髓背角calpain活化水平酵母多糖组大鼠制模后4、24、48 h腰段脊髓背角内spectrin αⅡ BDP的相对含量分别为265.33±52.11、272.26±44.89、301.65±56.34，与对照组 (100)和假手术组 (96.23±15.61)相比均显著增加 (P＜0.01)，提示酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠腰段脊髓背角内calpain活性增强 (图1)。

假手术组、Z+V组和Z+A组大鼠MWT假手术组大鼠制模后各时间点MWT与第一部分实验结果差异无统计学意义 (P＞0.05)。与假手术组大鼠制模后相同时间点比较，Z+V组大鼠各时间点MWT均显著降低 (P＜0.05);Z+A组大鼠制模后0.5、1、2、4、48 h MWT显著下降 (P＜0.05)，而8 h和24 h MWT差异无统计学意义 (P＞0.05)。与Z+V组大鼠相同时间点比较，Z+A组大鼠制模后4、8、24、48 h MWT明显增高 (P＜0.05)(表3)。

假手术组、Z+V组和Z+A组大鼠左侧后足足底最大厚度假手术组大鼠制模后各时间点左侧后足足底最大厚度与第一部分实验结果差异无统计学意义 (P＞0.05)。与假手术组大鼠制模后相同时间点比较，Z+V组大鼠各时间点左侧后足足底最大厚度均显著增加 (P＜0.01)，Z+A组大鼠在制模后各时间点左侧后足足底最大厚度亦显著增加 (P＜0.05)。但与Z+V组大鼠相同时间点比较，Z+A组大鼠在制模后4、8、24、48 h左侧后足足底最大厚度显著减小 (P＜0.05)(表4)。

图1 对照组、假手术组、酵母多糖组大鼠制模侧脊髓背角spectrin αⅡ BDP(calpain活化)水平Fig 1 Western blot analysis of spectrin αⅡ BDP(calpain activity)level in the ipsilateral lumbar spinal dorsal horn of rats after surgery

表2 制模后各时间点对照组、假手术组、酵母多糖组大鼠左侧后足足底最大厚度比较 (±s，mm)Table 2 Maximum thickness of the left hind paw of zymosan-induced inflammatory pain rats compared with control and sham-operated groups at different time points after the surgery(±s，mm)

表2 制模后各时间点对照组、假手术组、酵母多糖组大鼠左侧后足足底最大厚度比较 (±s，mm)Table 2 Maximum thickness of the left hind paw of zymosan-induced inflammatory pain rats compared with control and sham-operated groups at different time points after the surgery(±s，mm)

与对照组比较，aP＜0.01;与假手术组比较，bP＜0.01aP＜0.01 compared with control group;bP＜0.01 compared with sham-operated group

Group 0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h对照组Control group 5.07±0.20 5.04±0.15 5.01±0.17 4.99±0.16 5.17±0.20 5.00±0.18 5.07±0.15 5.05±0.22假手术组Sham-operated group 4.99±0.40 5.72±0.20 5.50±0.25 5.25±0.31 5.24±0.18 5.18±0.11 5.14±0.12 5.49±0.42组别酵母多糖组Zymosan group 5.02±0.41 10.84±0.21ab10.13±0.50ab 9.88±0.54ab10.39±0.35ab 8.89±0.75ab 7.86±0.84ab 7.72±0.38ab

表3 制模后各时间点假手术组、Z+V组、Z+A组大鼠机械刺激缩足阈值比较 (±s，g)Table 3 Mechanical withdrawal threshold of ALLN treated rats compared with sham-operated rats and DMSO treated rats at different time points after the surgery(±s，g)

表3 制模后各时间点假手术组、Z+V组、Z+A组大鼠机械刺激缩足阈值比较 (±s，g)Table 3 Mechanical withdrawal threshold of ALLN treated rats compared with sham-operated rats and DMSO treated rats at different time points after the surgery(±s，g)

DMSO:二甲基亚砜;Z+V:DMSO溶剂对照组;Z+A:ALLN治疗组;与假手术组比较，aP＜0.05，bP＜0.01;与Z+V组比较，cP＜0.05DMSO:dimethyl sulphoxide;Z+V:zymosan rats with DMSO treatment;Z+A:zymosan rats with ALLN treatment;aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with sham-operated group;cP＜0.05 compared with Z+V group

?

表4 制模后各时间点假手术组、Z+V组、Z+A组大鼠左侧后足足底最大厚度比较 (±s，mm)Table 4 Maximum thickness of the left hind paw of ALLN treated rats compared with sham-operated rats and DMSO treated rats at different time points after the surgery(±s，mm)

表4 制模后各时间点假手术组、Z+V组、Z+A组大鼠左侧后足足底最大厚度比较 (±s，mm)Table 4 Maximum thickness of the left hind paw of ALLN treated rats compared with sham-operated rats and DMSO treated rats at different time points after the surgery(±s，mm)

与假手术组比较，aP＜0.05，bP＜0.01;与Z+V组比较，cP＜0.05aP＜0.05，bP＜0.01 compared with sham-operated group;cP＜0.05 compared with Z+V group

组别Group 0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h假手术组Sham-operated group 5.09±0.24 5.93±0.30 5.55±0.24 5.06±0.65 5.14±0.23 5.02±0.12 5.18±0.33 5.11±0.24 Z+V组Z+V group 4.98±0.24 10.11±0.29b 10.28±0.47b 10.22±0.38b 10.44±0.36b 9.22±0.47b 8.06±0.91b 8.02±0.47b Z+A组Z+A group 5.02±0.33 9.99±0.25b 10.17±0.73b 9.82±0.25b 7.51±0.49bc 6.97±0.57bc 5.99±0.68ac 6.05±0.58

假手术组、Z+V组、Z+A组大鼠腰段脊髓背角COX-2表达水平Z+V组大鼠制模后4、24、48 h与假手术组相比，COX-2表达水平明显增加 (P＜0.01);Z+A组大鼠制模后4 h与假手术组比较，COX-2表达水平明显增加 (P＜0.01)，24 h和48 h与假手术组比较差异无统计学意义 (P＞0.05);Z+A组大鼠制模后4、24和48 h与Z+V组相同时间点比，COX-2表达水平明显下降 (P＜0.01)(图2，表5)。

图2 假手术组、Z+V组、Z+V组大鼠制模侧脊髓背角COX-2表达水平Fig 2 Western blot analysis of COX-2 level in the ipsilateral lumbar spinal dorsal horn of rats in sham-operated，Z+V，and Z+A groups

表5 假手术组、Z+V组、Z+A组大鼠制模侧脊髓背角COX-2表达水平比较 (±s)Table 5 COX-2 level in the ipsilateral lumbar spinal dorsal horn in sham-operated，Z+V，and Z+A groups(±s)

表5 假手术组、Z+V组、Z+A组大鼠制模侧脊髓背角COX-2表达水平比较 (±s)Table 5 COX-2 level in the ipsilateral lumbar spinal dorsal horn in sham-operated，Z+V，and Z+A groups(±s)

与假手术组比较，aP＜0.01;与Z+V组比较，bP＜0.01aP＜0.01 compared with sham-operated group;bP＜0.01 compared with Z+V group

组别Group 4 h 24 h 48 h假手术组Sham-operated group 100 Z+V组Z+V group 321.34±32.15a 450.65±40.23a165.78±20.18a Z+A组Z+A group 149.43±27.95ab 112.33±18.50b130.46±22.65

讨 论

本研究首先通过在大鼠足底皮下注射酵母多糖1.25 mg制作酵母多糖足底炎性疼痛大鼠模型。结果显示，制模后0.5 h开始，制模侧后足对机械刺激的敏感性增强;制模后1、2、4、8、24、48 h各时间点机械痛敏仍然存在。炎性水肿特点表现为制模后0.5 h左右开始迅速出现的足部水肿，并且持续超过48 h。这些特点与文献报道基本一致［4-5］，证实制模成功。酵母多糖组大鼠制模后4、24、48 h腰段脊髓背角内spectrin αⅡ BDP含量显著增加，提示酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠外周组织炎性损伤发生后腰段脊髓背角内calpain活性增强。

基于疼痛模型建立的结果，本研究随后采用腹腔注射calpain抑制剂ALLN干预酵母多糖模型大鼠，观察ALLN的镇痛作用;同时观察ALLN干预后模型大鼠腰段脊髓背角COX-2表达水平的变化。结果显示，ALLN可以显著缓解酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠制模后4、8、24、48 h的炎性疼痛和炎性水肿，并显著降低脊髓背角COX-2的表达，提示calpain抑制剂ALLN可在缓解炎性疼痛和炎性反应方面发挥重要作用。

目前有关calpain在炎性疼痛方面的研究尚少。已有研究表明，calpain可能通过降解神经微丝蛋白和p35参与炎性疼痛。Kunz等［3］研究显示，外周炎性损伤发生后，损伤局部和脊髓水平的calpain活化水平增强，后者通过降解神经微丝蛋白参与疼痛形成;使用calpain抑制剂MDL 28170可以显著缓解炎性疼痛。Pareek等［6］研究显示，伤害性神经元内表达有Cdk5和其激活因子p35。当外周炎症发生后，感觉神经元内的calpain活性增强，进而降解p35为p25，后者与Cdk5形成更稳定的复合体，使Cdk5活性增加，痛觉过敏加剧;通过抑制calpain活性可以有效缓解痛觉过敏。

除参与缓解炎性疼痛外，calpain抑制剂在抑制炎性反应、改善缺血性损伤和脊髓损伤等方面的作用也已被大量文献证实。有研究表明，calpain抑制剂在抑制急慢性炎症反应方面具有显著效果［7］。在内毒素诱发的循环衰竭和多器官功能障碍大鼠模型中，使用calpain抑制剂ALLN可以有效缓解循环衰竭，并改善肝脏、胰腺功能，缓解乳酸酸中毒和低血糖;同时降低内毒素休克大鼠诱导型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase，iNOS)和 COX-2蛋白的表达和活性［8］。Calpain抑制剂可以有效缓解脊髓缺血模型大鼠的运动功能［9］。Calpain抑制剂还可以通过抑制核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活化改善缺血性休克引起的器官功能障碍，同时抑制NF-κB下游iNOS和COX-2的表达［10］。

给药方式和给药剂量对疼痛模型的药物干预效果有很大影响。有研究显示，腹腔注射较大剂量calpain抑制剂可以取得与硬膜外腔注射较小剂量calpain抑制剂相同的镇痛效果，提示calpain抑制剂经外周给药和中枢给药具有同样的镇痛作用，但因为经中枢给药的剂量远远小于经外周给药的剂量，提示calpain抑制剂的镇痛效果主要是通过抑制脊髓和背根神经节内calpain的活性来实现的［3］。本研究选择腹腔注射的方式给予ALLN，剂量选择了文献 ［7］中报道的可以有效缓解急慢性炎性反应的ALLN剂量，获得了一定的抗炎镇痛效果。

本研究选择观察腰段脊髓背角COX-2的表达变化主要基于COX-2是外周炎症发生后引起脊髓前列腺素E2升高，进而扩大伤害性感受的主要物质［11］。炎性反应诱导COX-2表达后使前列腺素合成释放增加，后者通过促进伤害性神经纤维释放神经递质，以及直接激活位于背角神经元上的前列腺素类受体，引起外周伤害性神经末梢敏化，炎症局部出现痛觉过敏。同时，由于脊髓神经元兴奋性升高，还会引起其周围未损伤组织的痛觉过敏 (继发敏化)。因此测定脊髓COX-2的表达水平可以反映痛觉过敏的程度［12］。

ALLN治疗组大鼠MWT与溶剂对照组大鼠比较显著升高，炎性疼痛得到显著缓解，但仍未恢复到正常水平，说明ALLN干预只能部分缓解炎性疼痛。外周炎性损伤引起脊髓背角calpain显著活化后，使用calpain特异性抑制剂ALLN只能部分缓解炎性疼痛可能与以下机制有关:(1)炎性疼痛的形成和发展与许多信号通路密切相关，除已经研究证实的信号通路外，还存在许多未知信号网络，它们均可能对炎性疼痛的形成和发展产生影响。因此，单纯干预calpain一条信号通路并不能完全抑制炎性疼痛;(2)ALLN穿透细胞膜的能力不十分理想。目前大部分calpain抑制剂都存在细胞膜通透性相对较差的问题，因此不能完全作用于靶点，充分发挥抑制作用［13］。对细胞膜通透性强的特异性calpain抑制剂的进一步研发将可能解决这一问题; (3)ALLN的剂量选择可能会影响作用效果，本研究采用的ALLN剂量是根据文献中ALLN抑制急慢性炎性反应所使用的剂量，也可能存在进一步加大剂量会取得更好效果的可能性。

综上所述，酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠腰段脊髓背角calpain活化水平显著增强，通过腹腔注射calpain抑制剂ALLN可以显著缓解酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠的炎性疼痛和炎性水肿，同时显著降低脊髓背角COX-2的表达水平。提示calpain活化后可能通过促进脊髓水平COX-2表达增加，参与炎性疼痛的形成，通过抑制calpain活性可以有效缓解炎性反应及炎性疼痛。

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