人胚胎小脑皮质中神经生长因子阳性神经元的形态学观察

郑兰荣，邵金贵

皖南医学院病理解剖学教研室，安徽芜湖241002

神经生长因子 (nerve growth factor，NGF)是最早发现的神经营养因子，它是一种含有118个氨基酸的蛋白质，由一个β亚单位、两个α亚单位以及两个γ亚单位以非共价键结合形成，其中β亚单位是唯一具有活性的亚基［1］。大量的体外实验证实它是周围神经系统交感神经元、感觉神经元及中枢神经系统胆碱能神经元发育、分化和行使正常功能必不可少的营养因子［2］。小脑是中枢神经系统中最大的运动结构，是比较高级的躯体运动调节中枢。但是有关小脑胚胎发育阶段NGF阳性神经元的发育目前鲜见报道。因此，本研究应用免疫组织化学方法对胚胎发育时期小脑内NGF阳性神经元的发生、生长发育、形态演变及其分布特征进行较全面观察，并检测积分吸光度 (integral absorbance，IA)，以探索其生长发育规律。

材料和方法

胚胎收集与分组收集合法的发育正常、已经死亡的人胎标本29例 (研究经伦理委员会同意，每例标本的收集均经产妇本人同意并签署知情同意书)，根据测量其顶臀长，按Patten法［3］并结合其母体末次月经日期推算胎龄，以每4周为一月龄组，每月龄为一研究组，其例数分布如下:第3个月龄(9～12周)组4例，第4个月龄 (13～16周)组4例，第5个月龄 (17～20周)组5例，第6个月龄(21～24周)组6例，第7个月龄 (25～28周)组4例，第8个月龄 (29～32周)组6例。

取材和切片(1)开颅，沿胎尸左侧小脑半球同一部位垂直于小脑表面切取一组织块，于10%的甲醛水溶液中固定24 h;(2)梯度酒精脱水; (3)二甲苯通明:二甲苯1、2分两次各5 min的通明;(4)浸蜡:浸入70℃的蜡1 h;(5)包埋:用70℃蜡包埋，使包埋块于室温下自然冷却凝固;(6)切片:用组织切片机进行切片，每片厚5 μm，切片裱于涂有0.5%明胶的载片上，并放入60℃烤箱内烤1 h。

免疫组织化学染色常规脱蜡至水，3%的H2O2蒸馏水溶液孵育10 min，灭活内源性过氧化酶，将切片入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液 (pH 6.0)加热至沸腾后断电，5 min后再重复1次，自然冷却至室温，抗原修复液孵育10 min，滴加正常山羊血清封闭液孵育30 min，倾去封闭液，滴加兔抗nNOS血清 (1∶100)，4℃过夜，滴加即用型生物素标记的二抗 (羊抗兔IgG抗血清)孵育20 min，滴加即用型链霉素亲霉素酶复合物 (strept avidin-biotin complex，SABC)，孵育20 min，二氨基联苯胺 (diaminobenzidine，DAB)-H2O2染色液显色，以上各步之间均用缓冲液浸洗3遍，每遍5 min。显微镜下控制显色反应时间，磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline，PBS)终止显色，蒸馏水洗后，常规脱水，透明，封片，光镜观察。

对照实验用 PBS替代一抗、二抗作为阴性对照，用已知阳性片作为阳性对照。

结果判定和图像分析切片经染色后，NGF阳性神经元的胞膜和胞质呈黄色或黄褐色，细胞核不着色。用 NISDR专业图像处理分析软件 (日本Nikon)测定某一视野下NGF阳性染色细胞的IA，每张切片随机选取3个视野，对每份样本4张切片的3个视野阳性染色细胞的IA值取平均值，组间比较采用单因素方差分析。

统计学处理用 SPSS 11.15统计软件分析，数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行比较。

结 果

HE染色HE染色有助于辨认小脑皮质的组织结构，但不能辨认NGF阳性神经元 (图1)。

免疫组织化学观察用PBS替代一抗、二抗进行的免疫组织化学对照实验均未见NGF阳性神经细胞 (图2)。第3个月龄时，在小脑的室管层、中间层和边缘层均可见NGF阳性反应神经元，神经元胞体为圆形，大小不一，呈散在分布，神经元的一端或两端带有突起，有的突起较长，小脑血管内皮细胞和单核巨嗜细胞都出现典型的NGF强阳性物质(图3A)。第4个月龄时，室管层NGF阳性神经元胞体呈圆形，胞质少，核浆比大于1，在神经元的一端或两端见突起，中间层可见NGF阳性神经元和神经纤维分布，有的神经元胞体比室管层神经元胞体大，胞质相对增多，染色加深;边缘层NGF阳性神经元胞体较小，呈圆形或梭形，神经突起明显 (图3B);外颗粒层未见NGF阳性神经元。第5个月龄时，室管层NGF阳性神经元数量明显增多，胞体较小，呈圆形或椭圆形，胞质相对增多，突起伸长，蒲肯野细胞层呈NGF阳性表达，边缘层可见NGF阳性神经元胞体呈圆形或梭形，染色较深，有的神经元突起较长，有的较短，有的神经元有多个神经突起 (图3C)。第6、7个月龄时，蒲肯野细胞胞体增大，胞质增多，NGF染色加深，在神经元之间形成较密集的神经纤维网，边缘层NGF阳性神经元数量较多，胞体较小，呈圆形或椭圆形 (图3D、3E);内颗粒层NGF阳性神经元细胞数量和大小与第5个月龄相似;外颗粒层未见NGF阳性神经元。第8个月龄时，蒲肯野细胞胞体呈圆形或梨形，每个蒲肯野细胞都向分子层伸出多个粗大突起纤维，NGF阳性反应较强;分子层NGF阳性神经元数量增多，胞体较小，呈圆形，染色较深;颗粒细胞层NGF阳性神经元胞体较小，呈圆形，细胞质少，呈NGF阳性反应(图3F)。

IA值结果第3～8个月龄段IA值逐渐升高，且每两个月龄组IA值之间差异均有统计学意义 (P均＜0.05)(表1)，提示NGF在人胎小脑皮质神经元的阳性表达呈现由少到多的规律。

图1 第3个月龄人胚胎小脑皮质HE染色结果 (×400)Fig 1 HE staining results of cerebellar cortex of human fetus at the third month of gestation(×400)

图2 人胚胎小脑皮质免疫组化染色阴性对照实验结果 (×400)Fig 2 Negative control immunohistochemisty of experiment results of cerebellar cortex of human fetus(×400)

表1 NGF在不同胎龄小脑皮质神经元表达的积分吸光度Table 1 Expression of NGF in the cerebellar cortical neurons of different gestational ages quantified by integral absorbance

讨 论

胚胎中枢神经系统的发生，起源于脊索背面外胚层增厚的神经板，神经板凹陷形成神经沟，神经沟两侧高起的神经褶逐渐靠拢并联合，形成神经管，神经管的头端部分发育形成大脑、中脑、丘脑和小脑等。1970年Boulder神经科学会建议把分化中的神经管壁细胞分为4层:室管层、室管下层、中间层、边缘层。小脑皮质的神经元最初来源于室管层，室管层细胞经过不断分裂、增殖、迁移形成了中间层和边缘层。小脑的组织发生有别于中枢神经系统的其他部分，因为在小脑表面有一个次级增殖区，这个次级增殖区即为外颗粒层。它是自神经上皮层发生的一些细胞通过边缘层迁移到小脑表面下方，这层细胞被认为是移位的神经上皮细胞，仍保持分裂能力。胚胎第6个月龄时，自外颗粒层释放出NGF阳性神经细胞，向正在分化的蒲肯野细胞深层方向迁移，依次形成小脑的颗粒细胞、高尔基细胞和筐篮细胞［4］。

图3 第3～8个胎龄人胚胎小脑皮质中NGF阳性神经元细胞免疫组化染色结果 (SABC，×400)Fig 3 Immunohistochemisty of NGF-positive neurons in the ependymal layers of the cerebellum at the third to tenth month of gestation(SABC，×400)

NGF是一种蛋白类多肽，在生物体内广泛分布，中枢神经系统以及唾液腺、前列腺等都可以合成并分泌，具有神经元营养和促进神经元突起生长双重生物学功能［5-6］。本研究发现在胚胎第3个月龄时，小脑室管层、中间层和边缘层均可见NGF阳性神经元，形态特征是:胞体较小，胞质少，说明该月龄小脑内NGF活性较低，是NGF阳性神经元分化形成的早期阶段。并且在该月龄时可见小脑血管内皮细胞出现NGF阳性反应物质，提示NGF对血管内皮细胞的增殖及血管发生具有重要的意义。第4个月龄时，小脑初步分化为表面的皮质和中央的白质，胚胎早期的小脑皮质从表面向深部依次分为外颗粒层、边缘层、中间层和室管层。中间层NGF阳性细胞是小脑皮质发育、增厚和分化、迁移的主要细胞。本研究观察到，第4个月龄时，中间层NGF阳性神经元胞体较大，胞质较多，神经元之间出现NGF阳性神经纤维，表明该月龄中间层NGF阳性神经元合成和释放NGF的能力增强，使得小脑中间层局部NGF浓度升高，可能高浓度的NGF对小脑各种细胞的增殖、分化、迁移、生长具有重要作用。有文献报道，在胚胎发育期，NGF可诱导神经纤维定向生长，刺激胞体和树突的发育，促进神经元的分化和纤维的延长［7-9］。本研究结果表明，第5～7月龄时，室管层和边缘层NGF阳性神经元数目迅速增多，同时蒲肯野细胞NGF阳性逐渐增强，胞体变大，突起增粗伸长。从HE染色切片上看，这一时期也是小脑皮质迅速增厚、各种细胞由内向外和或由外向内大迁移的时期，进一步表明NGF不仅对NGF阳性神经元自身的生长发育，而且对小脑其他类型细胞的生长发育都具有重要作用。根据本研究的观察，第8个月龄时，小脑皮质3层结构已初具雏形，蒲肯野细胞及其他类型的NGF阳性神经元已基本发育成熟。

在胚胎第3～8个月龄时，IA值呈现逐月升高的趋势，提示这6个月内NGF在人胎小脑皮质各层均有阳性表达，且由弱到强。结合形态学观察，这些表明NGF不仅对该阶段人胚胎小脑皮质神经元和神经纤维起到诱导发育生长的关键作用，对蒲肯野细胞等其他类型细胞的生长发育也有一定的重要作用。

总之，形态学观察结果及IA值测量结果均表明，在人胚胎小脑皮质发育过程中，NGF在皮质中的表达呈由弱到强的变化规律，由此表明NGF在人胚胎小脑皮质的生长发育过程中起重要的作用。

［1］Leng S，He J，Fan W，et al.Bone mesenchymal stem cells for gene transfer of NGF to the adult rat brain:rescue the NGFR p75 positive neurons from fimbria-fornix lesion-induced degeneration ［J］.Neurosci Lett，2008，448(3):282-287.

［2］Bartkowska K，Turlejski K，Djavadian RL.Neurotrophins and their receptors in early development of the mammalian nervous system ［J］.Acta Neurobiol Exp(Wars)，2010，70(4):454-467.

［3］Patten BM.Human embryology［M］.2nd ed.New York:Blakison，1953:181-189.

［4］Eto R，Abe M，Kimoto H，et al.Alterations of interneurons in the striatum and frontal cortex of mice during postnatal development［J］.Int J Dev Neurosci，2010，28(5):359-370.

［5］Volosin M，Song W，Ineida RD，et al.Interaction of survival and death signaling in basal foreb rain in neurons roles of neurotrophins and proneurophins ［J］.J Neurosci，2006，26(29):7756-7766.

［6］Schulte-Herbrüggen O，Eckart S，Deicke U，et al.Age-dependent time course of cerebral brain-derived neurotrophic factor，nerve growth factor，and neurotrophin-3 in APP23 transgenic mice ［J］.J Neurosci Res，2008，86(12):2774-2783.

［7］Thoene H，Barde YA.Physiology of nerve growth factor［J］.Physiol Rev，1980，60(4):1284-1291.

［8］李力燕，刘佳，杨金伟，等.NGF在人胚胎脊髓中的表达及变化 ［J］.昆明医学院学报，2007，28(4):1-5.

［9］李龙，王忠荣，王亮.神经生长因子及其受体在人胚胎结肠神经系统中的表达与分布 ［J］.实用医学杂志，2006，22(17):1961-1963.