ES 细胞体外定向分化为睾丸间质样细胞模型的建立

张莹莹，黄亚东，葛仁山，朱丹雁

(1.浙江大学药学院 药理毒理与生化药学研究所，浙江 杭州 310058;2.暨南大学生命科学技术学院，广东 广州 510632;3.美国洛克菲勒大学，美国人口理事会，生物医学研究中心，纽约 10065)

睾丸间质细胞(leydig cells)是体内合成分泌睾酮的主要细胞［1］，它分布于生精小管之间的疏松结缔组织中，其含量占睾丸细胞数量的2%～4%。目前男性更年期综合征，即中老年男子雄激素部分缺乏或中老年男性性腺功能减退是当前普遍关注的社会问题。临床主要应用化学合成的雄性激素进行替代治疗，长期应用易引起肝功能损害、高血脂症及前列腺癌等并发症。近年来国内外专家尝试开展了近亲供体移植术或干细胞移植术治疗睾丸损失或男性性腺低下症，取得较好效果。但这种移植术存在供体来源有限、手术复杂、经费高、受者需长期服用免疫抑制剂等缺点。胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES)在体外合适的培养条件下，可以定向分化为各种细胞类型，并可以替代器官中死亡或损伤的细胞恢复其正常功能。在男性生殖发育研究领域，对于睾丸间质细胞的发育起源研究相对较少。尚未见由ES-D3细胞定向分化为睾丸间质细胞及其影响分化发育机制相关报道，更未见利用该模型评价调节睾丸间质细胞分泌睾酮功能为靶点促细胞分化剂的研究报道。

类固醇生成因子1(steroidogenic factor 1，SF-1)对生成类固醇酶的表达起重要调控作用，同时影响性腺发育过程。类固醇的生成需要SF-1 及其下游靶基因调节类固醇生成酶和胆固醇向激素转化通路的调控［2-3］。在睾丸发育过程中，SF-1 调节StAR、P450scc 和3β-HSD1转录，活化CYP17A 启动子［4-5］。已有文献报道SF-1 在ES 细胞中是不表达的，但在ES-RW4细胞株中稳定表达SF-1，是RA 和8Br-cAMP 诱导ES-RW4 分化时促进类固醇生成所必需的［6］。

本实验通过对小鼠ES-D3 细胞转染SF-1质粒，同时采用RA 和8Br-cAMP 联合诱导，建立ES 细胞体外定向分化为睾丸间质样细胞(leydig-like cells)模型，有利于阐明睾丸间质样细胞分化发育的相关机制，为进一步研究以调节睾丸间质细胞分泌睾酮功能为靶点的促细胞分化剂提供实验模型。

1 材料与仪器

1.1 细胞系 小鼠ES-D3 细胞购买自美国ATCC 公司。

1.2 主要试剂 胎牛血清和高糖DMEM(Gibco 公司);非必需氨基酸(the non-essential amino acids，NEAA，美国Hyclone 公司);β-巯基乙醇(β-Me，Sigma 公司);重组小鼠白血病抑制因子(Leukaemia Inhibitory Factor，LIF，美 国Chemicon 公司);全反式维甲酸(Retinoic acid，RA)、8Br-cAMP (Sigma 公司);DMSO(Dimethylsulfoxid，Amerisco 公司);PCR 相关试剂(上海生物工程技术服务有限公司);抗体3β-HSD1、P450scc、StAR(Abcam 公司);辣根过氧化物酶标记抗兔IgG 和抗鼠IgG(Santa Cruz公司);DyLight 488 标记抗兔 IgG 和DyLight488 标记抗鼠IgG(Santa Cruz 公司);DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，Sigma 公司);转染试剂Effectene Transfection Reagent(QIAGEN 公司);pIRES2-EGFP 及p-EGFP-SF1质粒(英潍捷基贸易有限公司)。

1.3 主要仪器 超净工作台(Forma l851);CO2孵箱(Forma 3l11);离心机(Eppendoff 公司);荧光倒置显微镜(LEICA MPS 3O 型);蛋白质电泳及电转移装置(北京六一仪器厂);PCR 仪(Eppendoff 公司);凝胶成像仪(Bio-Tek公司)。

2 方 法

2.1 SF-1 质粒构建 将SF-1 基因合成并构建到pIRES2-EGFP 载体，对含有目的基因的pIRES2-EGFP 以及空载进行大量抽提，最后得到含目的基因片断的pIRES2-EGFP 载体质粒和空载用于后续实验。由英潍捷基贸易有限公司合成。基因序列如下:

2.2 小鼠ES 细胞转染SF-1 质粒并进行诱导分化 用含10%胎牛血清、0.1%LIF 的高糖DMEM 将ES 细胞制成单细胞悬液(25 万个/ml)，以每孔40 万细胞量接种于6 孔板。每孔2μg 质粒量按Effectene Transfection Reagent Handbook 进行转染，以空质粒转染和未转染组作对照。转染24 h 后，去除上清液，加入含有10%胎牛血清的分化培养液，并加入RA 和8Br-cAMP，终浓度分别为5×10-7μmol/L 和1 mmol/L，诱导分化培养48 h。

2.3 观察ES 细胞SF-1 质粒转染效率及分化中细胞形态变化 对转染SF-1 质粒24 h 及分化48 h 后的ES 细胞进行光镜及荧光显微镜观察，每个孔随机取4个视野，分别在普通光及荧光下拍照，通过图像分析统计每组显示荧光的细胞数平均值，并计算转染效率。拍照记录分化中的细胞形态变化。

2.4 免疫荧光法检测ES 细胞分化而来的细胞中P450scc 及3β-HSD1 表达 取ES 细胞经转染并分化的样本，用磷酸缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)洗两遍，纯冷甲醇固定15 min，再用含5%胎牛血清PBS/TritonX-100 处理1 h，然后分别加入一抗:①rabbit polyclonal anti-P450scc，1∶500 稀释;②mouse monoclonal 3β-HSD1，1∶500 稀释，4℃孵育过夜。第2天用PBS洗3遍，加入二抗:①DyLight 488 conjugated of rabbit anti-rabbit IgG，②DyLight 488 conjugated of goat anti-mouse IgG，1∶200 稀释，37℃孵育1 h 后用PBS 清洗，DAPI 染色，用荧光显微镜观察，拍照记录。

2.5 RT-PCR 法检测相关基因表达情况 分别收集转染SF-1 24 h 后的ES 细胞及经诱导分化的细胞，按照Trizol reagent 说明书提取总mRNA，3μg RNA 逆转录后PCR 扩增。引物序列见表1。PCR 产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，核酸染料代替物染色后，用凝胶成像系统观察及拍照分析。

表1 引物序列及PCR 反应条件Table 1 Primers and conditions for reverse transcription-polymerase chain reaction

2.6 Western Blot 法检测相关蛋白表达 收集分化细胞样本，4℃冰浴上加入裂解液(pH 7.5 20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% Triton X-100，0.5% deoxysodium cholate，10 mmol/L PMSF，1μg/ml aprotinin，2 mg/ml leupeptin)，在冰上多次反复吹打30 min，4℃13 000×g 离心30 min 获得上清即为总蛋白，Lowry 试剂盒法(DC 蛋白检测试剂盒，Bio-Rad，CA，US)对蛋白浓度进行定量，分装后冻存备用。SDS-PAGE，蛋白免疫印记和胶片光密度分析方法按常规操作。SDS-PAGE 后将蛋白电转膜至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗mouse monoclonal to StAR、rabbit polyclonal anti-P450scc、mouse monoclonal 3β-HSD1，1∶1 000 稀释，加于5%脱脂奶中，4℃孵育过夜。洗膜3次，继续孵育相应二抗，1∶5 000 稀释。相同条件下洗膜3次，用ECL 试剂显色，暗室中用X 光胶片曝光。

3 结果

3.1 SF-1 转染ES 细胞定向分化为睾丸间质样细胞的形态变化 ES-D3 细胞转染带有绿荧光蛋白的SF-1 质粒24 h 后，荧光显微镜下即可见发绿色荧光的细胞。视野观察转染效率达30%～40%，转染效率达到基因转染要求(图1A)。RT-PCR 结果表明，未转染组、转染空质粒组的ES 细胞均无SF-1 基因表达，而转染SF-1质粒的ES 细胞表达SF-1 基因(图1B)，提示SF-1 转染成功并在ES 细胞内表达。ES 细胞转染SF-1 后加入RA 和8Br-cAMP 诱导分化48 h，出现较多胞体大而圆润，长有触角的纺锤形细胞，而其他对照组分化的细胞形态杂乱，没有出现睾丸间质样细胞形态(图1C)。

图1 SF-1 转染ES 细胞的表达及分化形态学观察Fig.1 The expression and the apparent morphological changes of ES cells transfected with the plasmid SF-1

3.2 RT-PCR 和Western Blot 法检测ES 细胞分化为睾丸间质样细胞StAR、P450scc、3β-HSD1表达 RT-PCR 结果显示，转染SF-1 的ES-D3 细胞在RA 和8Br-cAMP 诱导下分化而来的细胞，与对照组比较，StAR 表达增加，睾丸间质细胞特异性基因P450scc 和3β-HSD1 出现显著表达，但仅转染SF-1 并无RA 和8Br-cAMP诱导时，StAR 表达不变，P450scc 和3β-HSD仍无表达(图2A)。Western Blot 结果与PT-PCR 结果一致(图2B)。结果提示，ES-D3细胞转染SF-1 并在RA 和8Br-cAMP 诱导下，才能定向分化为睾丸间质样细胞，仅转染SF-1或仅以RA 和8Br-cAMP 诱导，并不能使ES-D3细胞向睾丸间质样细胞分化。

3.3 免疫荧光法检测ES 细胞分化为睾丸间质样细胞中P450scc 和3β-HSD1 表达 ES-D3细胞转染SF-1 质粒并经RA 和8Br-cAMP 诱导分化48 h 后，分化而来的睾丸间质样细胞中P450scc 和3β-HSD 有显著表达，而转染空质粒组分化后的细胞中P450scc 和3β-HSD 均无表达。此结果进一步证实转染SF-1 的ES-D3 细胞能分化成睾丸间质样细胞，明显表达睾丸间质细胞特异性标志物蛋白(图3)。

3 讨论

目前，关于睾丸间质细胞起源的相关研究报道较少，且主要由睾丸间质干细胞分化，而由ES 细胞分化为睾丸间质细胞的研究很少。ES细胞较睾丸间质干细胞更容易获得，其分化模型能模拟体内复杂发育过程，富含大量生物信息，是高仿真胚胎发育体外研究的替代系统，有广阔的应用前景。Teerds 等报道［7］睾丸间质干细胞在体外向睾丸间质细胞分化过程中，3β-HSD阳性表达为睾丸间质前体细胞的标志，随后出现P450scc、P45017α、LHR 蛋白表达［8］。

Crawford［6］等报道证明了小鼠ES-RW4 细胞转染SF-1 后，SF-1 的稳定表达能改变ES 细胞形态，允许RA 和8Br-cAMP 诱导内源性侧链分裂酶基因的表达，最后促进类固醇的生成。并且SF-1 发挥作用是通过其一定区域实现的，若其DNA 结合域或AF2 转率激活区被阻断后，则不能发挥其正常功能。SF-1 不仅参与发育过程，而且对ES 细胞向生成类固醇的细胞分化启动有非常重要作用。

本实验采用ES-D3 细胞株，转染含SF-1 基因序列的质粒，使SF-1 提前在ES 细胞中表达，同时在RA 和8Br-cAMP 诱导下，使ES 定向分化为睾丸间质样细胞。结果表明，分化而来的睾丸间质样细胞呈纺锤形，表达与类固醇生成有关特异性酶。进一步验证了SF-1 表达是ES细胞定向分化为睾丸间质样细胞所必需的，RA和8Br-cAMP 能有效诱导表达SF-1 基因的ES细胞分化为睾丸间质样细胞，而分化比率需进一步采用流式细胞术定量分析。据相关文献报道［6-8］StAR、P450scc 和3β-HSD1 是睾酮合成过程中的重要蛋白，同时也是睾丸间质前体细胞的标志，因此，本实验以StAR、P450scc 和3β-HSD1从无到有作为ES 定向分化为睾丸间质样细胞成功的标志，而睾酮分泌是睾丸间质细胞的功能，亟待后续试验中进行。该分化模型的建立将有利于阐明睾丸间质样细胞分化发育的相关机制，为进一步评价调节睾丸间质样细胞分泌睾酮功能为靶点的促细胞分化剂提供实验模型。

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